Изучение структуры и метаболизма отдельных фракций неорганических полифосфатов у дрожжей Saccharomyces сerevisiae

• Автор: Трилисенко, Людмила Васильевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 114 с. : ил.

ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУ РЫ
Глава 1. Полифосфаты, их локализация в клетках дрожжей, метаболизм и
функции
1.1. Содержание, локализация и длина цепи фракций полифосфатов в клетках дрожжей
1.1.1. Содержание полифосфатов
1.1.2. Фракции полифосфатов и их локализация в метках дрожжей
1.1.3. Длина цепи полифосфатов у дрожжей
1.2. Динамика содержания полифосфатов в клетках в процессе роста дрожжей
1.3. Явление гиперкомпенсации полифосфатов у микроорганизмов
1.3.1. Прокариоты
1.3.2. Эукариоты
1.4. Синтез и деградация полифосфатов в клетках дрожжей
1.4.1. Пути синтеза
1.4.2. Ферменты деградации
1.5. Функции полифосфатов в клетках дрожжей.
Глава 2. Влияние ингибиторов на содержание полифосфатов в клетках
дрожжей
Глава 3. Влияние инактивации генов полифосфатного метаболизма на уровень полиР в клетках мутантов А. сегеутае
ЧАСТЬ 2. МАТЕРИАЛЫ Й МЕТОДЫ.
2.1. Объект исследования
■2.2. Условия культивирования
2.3. Получение биомассы клеток
2.4. Получение сферопластов из клеток дрожжей
2.5. Выделение вакуолей
2.6. Методы экстракции полифосфатов
2. б. 1. Метод Лангена и Лисса в модификации Кунаева и др
2.6.2. Метод Лангена и Лисса в модификации Чернышевой и др
■ 2.6.3. Метод Кларк и др
2.7. Определение различных фосфорных соединений во фракциях
2.8. Сорбция нуклеотидов на уголь
2.9. Подготовка образца полиР для 31Р-ЯМР-спектроскопии
.2.10. Рабочие параметры прибора при снятии 31Р-ЯМР-спектров полиР
2.11. Количественные методы определения фосфора
2.11.1. Метод Берепблюмаи Чейна в модификации Вейль - Малербе и Грииа
2.11.2. Метод Якке и др
2.12. Определение белка по методу Лоури в модификации Петерсона
2.13. Определение глюкозы
2.14 Разделение экзополифосфатаз I и II цитозоля
2.15. Определение ферментативных активностей
2.15.1. Определение экзополифосфатазной активности цитозоля
2.15.2. Определение экзополифосфатазной активности вакуолей
2.15.3. Определение А ТФазнои активности вакуолей
2.15.4. Определение а-маннозидазы
2.14.5. Определение о.-глюкозидазы. '
2.16. Очистка полиР от примесей низкомолекулярных компонентов
2.17. Определение сухой биомассы клеток дрожжей. 53 ЧАСТЬ 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Сравнительный анализ фракций полифосфатов, выделенных различными методами из клеток X сегеу'тюе
3.2. Зависимость содержания и длины цепи фракций полифосфатов от фазы роста дрожжей Б .сегехпзгае
3.2.1. Изменение содержания фракций полифосфатов в процессе роста дрожжей
3.2.2. Изменение длины цепи отдельных фракций полифосфатов в процессе роста дрожжей
3.3. Влияние концентрации Р; в среде на накопление и степень полимерности различных фракций полифосфатов у дрожжей Б. сегех’тае
3.3.1. Подбор оптимальных условий культивирования дрожжей,
обеспечивающих феномен гиперкомпенсации полифосфатов
3.3.2. Диисытка содержания полифосфатов в клетках дрожжей в условиях фосфорного голодания и гиперкомпенсации
5.5.3. Изменение длины цепи полифосфатов в клетках дрожжей в условиях
. фосфорного голодания и гиперкомпенсации
3.4. Псшифос.фатазная активность в дрожжевых сферопластах и вакуолях в условиях фосфорного голодания и гиперкомпенсации полиР
3.5. Влияние ингибиторов на накопление полифосфатов у Л' ,сеге’іхіае
в условиях интенсивного их синтеза
3.6. Влияние инактивации генов РРХ1 и РРЫ1 на уровень полифосфатов у
3. сегез'іліае
Заключение
Выводы
Список литературы

молибдат-ацетонового реактива, состоящего из 1 мл 2,5%-го раствора (NHU^-MoC^ в 4 М НС1,
] мл дистиллированной воды и 2 мл ацетона. Содержимое пробирок тщательно перемешивали и для связывания избыточного молнбдата аммония добавляли 0,4 мл 1 М раствора лимонной кислоты. После тщательного перемешивания пробирки центрифугировали (если раствор был мутным) 10 мин при 2300 g. Поглощение в надосадочной жидкости опытной пробы измеряли против, контроля (вода плюс реактивы) на фотоколориметре КФК-3 при А.=410 нм в кювете шириной 10 мм.
2.12. Определение белка по методу Лоури в модификации Петерсона
(Peterson, 1977).
Образец, содержащий 5-100 мкг белка, доводили до 1 мл дистиллированной водой. Добавляли 0,1 мл 0,15 % дезоксихолата натрия (ДОХ), перемешивали и оставляли на 10 мин при комнатной температуре. Затем добавляли 0,1 мл 72 % ТХУ, перемешивали и центрифугировали при 3000 g в течение 15 мин. Супернатант сливали, его остатки тщательно удаляли фильтровальной бумагой. Данная стадия опускалась, если интерферирующие вещества отсутствовали.
Образцы белка (5-100 мкг) доводили до 1 мл. дистиллированной водой (осадок или аликвоту исследуемого раствора). Добавляли 1 мл реагента А, перемешивали и оставляли на 10 мин при комнатной температуре. При этом происходит растворение белок-ДОХ-ТХУ осадка. Затем добавляли 0,5 мл реагента. Б и сразу перемешивали. Окраске позволяли развиваться в течение 30 мин, а затем измеряли экстинкцию при 750 нм. Для построения калибровочной кривой использовали БСА.
Реактивы:
реагент А: смешиваются в равных частях 0,8 М NaOH, 10% ДС-натрия, раствор СТС (состав: 0,1 % CuS04, 0,2 % цитрат натрия, 10 % Na2C03) и дистиллированная вода.
реагент Б: 1 объем 1 М реактива Фолина- Чиокалътеу (Folin and Ciocalteau, 1927) смешивается с 2 объемами дистиллированной воды.