Направленный мутагенез пенициллинацилазы из Escherichia coli для изменения каталитических свойств и стабильности

• Автор: Панин, Николай Владимирович
• Шифр специальности: 02.00.15, 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 200 с. : ил.

Диссертация посвящается светлой памяти моего отца Папина Владимира Григорьевича.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1Л Пеницнллинацилаза
1.1.1 Общие сведения
1.1.1.1 Физиологическая роль ПА
1.1.1.2 Каталитическая активность
1.1.1.3 Субстратная специфичность
1.1.1.4 Стереоспецифичность
1.1.2 Основные области применения ПА
1.1.2.1 Получение бета-лактамных антибиотиков
1.1.2.2 Разделение энантиомеров аминосоединений
1.1.3 Структурно-функциональные особенности есПА
1.1.3.1 Структура предшественника
1.1.3.2 Активный центр
1.1.3.3 Механизм катализа
1.1.3.4 Конформационные переходы в активном центре
1.1.3.5 Участок связывания ацильной части
1.1.3. б Участок связывания амидной части
1.1.3.7 Локализация участка связывания бета-лактамных нуклеофилов
1.2.Белковая инженерия и поиск новых ПА
1.2.1 Поиск природных ПА
1.2.2 Белковая инженерия ПА

1.2.2.1 Случайный мутагенез
1.2.2.2 Направленный ліутагенез
1.2.2.3 Комбинированные методы
1.2.2.4 Расширение возможностей белковой инженерии
1.2.3 Заключение
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Материалы и оборудование
2.2 Методы
2.2.1 QuikChange ПЦР мутагенез
2.2.2 ПЦР мутагенез с перекрыванием
2.2.3 Наработка биомассы
2.2.4 Выделение и очистка мутантных препаратов ПА
2.2.5 Приготовление компетентных клеток
2.2.6 Электрофорез в агарозном геле
2.2.7 Электрофорез в полиакриламидном геле
2.2.8 Секвенирование
2.2.9 Титрование активных центров
2.2.10 Определение кинетических параметров гидролиза цветного субстрата
2.2.11 Изучение pH- и термостабильности
2.2.12 Ингибиторный анализ
2.2.13 Определение параметра S/H
2.2.14 Определение параметров (3 и у
2.2.15 Определение параметра а
2.2.16 Определение максимального выхода реакции
2.2.17 Определение стереоселективиости в реакции ацилирования 2-аминобутанола и
фенилаланинола

С другой стороны, такое расположение аминогруппы нуклеофила оказывается благоприятным и для связывания бета-лактамного ядра. Поскольку взаимная ориентация аминогруппы и остальной части субстрата жестко связаны, фиксация аминогруппы в активном центре фермента ведет к тому, что карбонильный кислород 4-х членного кольца и карбоксильная группа субстрата связываются в строго определенном месте, а именно, образуют водородные связи с остатками Ы1263, Ь8386.
Сравнение сайтов связывания бета-лактамного ядра в продуктивных комплексах Пен-в и 6-АПК показывает ряд существенных различий. Если в продуктивном комплексе Пен-в карбоксильная группа бета-лактамного ядра связывается с остатком ЬЫ388 и находится в непосредственной близости от аргинина ЬК263, то 6-АПК в комплексе с ацилферментом более подвижна, и ее карбоксильная группа в большей степени экспонирована в раствор, располагаясь практически на равном расстоянии от обоих положительно заряженных остатков активного центра - аК.145 и Ы1263, при этом с остатком ЬЯ263 молекула нуклеофила образует водородную связь своим карбонильным кислородом, а остаток аШ45 контактирует исключительно с гидрофобной частью 6-АПК (рис. 13).