Каталитическое поведение железо-молибденового кофактора нитрогеназы вне белка

• Автор: Баженова, Мария Анатольевна
• Шифр специальности: 02.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 124 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
Сокращения
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Биологическая фиксация азота
Состав и строение белковых компонентов нитрогеназ
Железо-молибденовый кофактор нитрогеназы (БеМосо)
Альтернативные нитрогеназы
Субстраты и ингибиторы нитрогеназы
Функционирование нитрогеназы
Химические модели нитрогеназы
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Методы получения и очистки реагентов
Получение образцов БеМосо: выделение из белка и оценка
качества препарата
Электрохимические измерения
Проведение экспериментов по изучению каталитической
активности БеМосо вне белка
Определение активности системы (II) к восстановлению
молекулярного азота
Аналитические процедуры
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Выбор и особенности систем, позволяющих
изучать каталитическую активность БеМосо вне белка
Выделение БеМосо из белка
Электрохимическое и биохимическое исследование
отделенного от белка БеМосо
Кинетические закономерности восстановления ацетилена,
катализируемого БеМосо вне белка
Ингибирование
ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
Биологическая фиксация азота, осуществляемая ферментом нитрогеназой, является одним из важнейших природных процессов. Ключевой стадией этого сложного процесса является восстановление атмосферного азота до аммиака, который затем используется в синтезе разнообразных азотсодержащих соединений, в частности, белков. Участвуя в кругообороте азота в природе, нитрогеназа выполняет важнейшую функцию обогащения почвы связанным азотом и, таким образом, обеспечивает поддержание жизни на планете.
Всестороннее изучение фермента нитрогеназы активно ведется уже более тридцати лет, и к настоящему времени получена обширная информация о составе, структуре, физикохимических свойствах и функциях составляющих нитрогеназу белков, однако реальный химический механизм активации и восстановления азота и других субстратов в активном центре фермента - на железо-молибденовом кофакторе нитрогеназы (FeMoco) - до сих пор не известен. Существует несколько подходов к изучению механизма превращения субстратов в активном центре: во-первых, ведутся исследования нитрогеназных систем in vitro, как нативной, так и мутантных; во-вторых, проводят исследования модельных металлокомплексных систем, способных к фиксации азота в обычных химических условиях, либо исследования химических свойств металлокластеров, сходных по составу и структуре с кластером FeMoco; в-третьих, изучают возможности взаимодействия субстратов и ингибиторов нитрогеназы с FeMoco, отделенным от белка.
Задача введения выделенного из белка FeMoco в реакции с субстратами нитрогеназы и изучения его как катализатора этих реакций к началу наших исследований решена не была. Исследование поведения металлокластера FeMoco вне белковой матрицы позволяет преодолеть кинетические ограничения, существующие в белковой нитрогеназной системе, которые препятствуют полной расшифровке детального механизма превращения субстратов в активном центре фермента. Также такой подход позволяет прояснить роль белкового окружения активного центра нитрогеназы в осуществлении ферментом его функции. Понимание реального химического механизма одного из самых красивых и сложных ферментативных процессов - восстановления молекулярного азота нитрогеназой - не только представляет интерес для фундаментальной науки само по себе, но и, в свою очередь, могло бы стать научной основой создания принципиально новых экологически чистых катализаторов и процессов, основанных на использовании принципов, найденных в ходе эволюции живой природы.

Цель работы
Данная работа была направлена на получение информации о механизме превращения субстратов в продукты в активном центре нитрогеназы, посредством изучения реакционной способности отделенного от белковой матрицы РеМосо в чисто химических условиях.
Работа включала следующие задачи:
1. Нахождение условий, в которых выделенный из белка РеМосо способен катализировать реакции восстановления субстратов нитрогеназы.
2. Изучение кинетических закономерностей найденных реакций, а также реакций РеМосо с ингибиторами нитрогеназы, с целью сравнения каталитического поведения РеМосо вне белка и в составе фермента.
3. Получение информации о механизме превращения субстратов на РеМосо.
4. Изучение возможности восстановления на отделенном от белка РеМосо основного субстрата нитрогеназы - молекулярного азота.
Научная новизна
В работе впервые найдены условия и показана принципиальная возможность введения РеМосо, отделенного от белковой матрицы, в реакции с субстратами нитрогеназы в чисто химических условиях. Показано, что железо-молибденовый кофактор является активным катализатором восстановления ацетилена и других субстратов нитрогеназы, если обеспечены условия сохранения кластерной структуры катализатора в ходе реакции, а также перенос электронов и протонов к активированной молекуле субстрата. Проведено изучение кинетических закономерностей катализируемой РеМосо реакции восстановления ацетилена, изучено влияние СО - ингибитора нитрогеназы - на эту реакцию; на основании полученных данных предложен механизм восстановления ацетилена с участием РеМосо, а также сделан ряд заключений относительно характера взаимодействия субстратов и ингибиторов с отделенным от белка РеМосо. Сравнение каталитического поведения выделенного РеМосо в реакциях восстановления ацетилена и ингибирования этого процесса оксидом углерода (II) и молекулярным азотом с таковым для ферментативной системы показало значительное сходство основных закономерностей этих реакций для фермента и химических систем с участием кофактора. Сделан вывод, что наблюдаемые особенности в первую очередь определяются составом и структурой РеМосо, и проявляются им независимо от природы (белковой или небелковой) восстановителя и среды реакции. Впервые установлено, что РеМосо и вне белкового окружения способен эффективно координировать молекулярный азот.

Итак, даже небольшое количество оксида углерода (II) ингибирует восстановление азота и других субстратов, но даже при очень больших концентрациях СО не ингибирует гидролиз АТФ, перенос электрона от Ре белка к МоРе белку и АТФ-зависимое выделение водорода (исключения будут рассмотрены ниже).
Тип ингибирования СО восстановления субстратов нитрогеназы до сих пор однозначно не определен: хотя в большинстве работ утверждается, что ингибирование неконкурентное, есть данные о конкурентном характере ингибирования, и о наличии признаков ингибирования обоих типов (даже по отношению к одному и тому же субстрату). Показано, что ингибирование СО обратимо [84]. Важной особенностью взаимодействия СО и нитрогеназы является тот факт, что молекула СО, будучи изоэлектронной молекуле N2, в отличие от последней не восстанавливается нитрогеназой.
Константа ингибирования СО меняется в широких пределах в зависимости от типа нитрогеназы (классическая молибденовая, альтернативная, гибридная), типа субстрата и соотношения белковых компонентов нитрогеназы, то есть величины электронного потока от Ре белка к большему белковому компоненту [10, 94]. При переходе от Мо нитрогеназы к альтернативным, так же как с уменьшением величины электронного потока, константа ингибирования СО растет [94].
Довольно давно было обнаружено, что при взаимодействии СО с нитрогеназой в условиях каталитического цикла наблюдается образование одного или двух, в зависимости от концентрации СО, сигналов ЭПР (8 = ‘Л) [50]. Один из сигналов образуется при давлении СО менее 1 кПа (такое давление СО и соответствующий сигнал обозначают 1о-СО); при больших давлениях СО первый сигнал исчезает, и наблюдается образование второго сигнала ЭПР (обозначаемого Ы-СО). Причем, в результате изучения методом ЭПР селективно меченных э7Ре Ре- и МоРе белков показано, что образование обоих сигналов происходит за счет взаимодействия СО именно с МоРе белком [50].
Позднее, с использованием метода 13С ЕРГООК авторами [102] было впервые прямо показано связывание СО с МоРе белком нитрогеназы. Найдено, что: оба сигнала ЭПР, 1о-СО (0.08 атм СО) и Ы-СО (0.5 атм СО), наблюдаемые в ходе катализа, являются следствием связывания СО с одним и тем же металлокластером (делалось предположение, позднее опровергнутое, что это Р-кластер); сигнал 1о-СО соответствует одной молекуле СО, связанной с кластером, а сигнал Ы-СО - двум, причем между двумя этими формами возможен взаимный переход - по сути, присоединение или уход одной из молекул СО. Молекула СО, связывающаяся при низком давлении СО, кинетически лабильна.