Выделение и характеристика порообразующих белков из Yersinia ruckeri

• Автор: Чистюлин, Дмитрий Константинович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 110 с. : ил.

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Структура и свойства порообразующих белков наружной мембраны

грамотрицательных бактерий и методы их исследования

2.1. Строение наружной мембраны грамотрицательных

бактерий

2.2. Общая характеристика порообразующих белков грамотрицательных

бактерий

2.2.1. Физико-химические свойства неспецифических поринов

2.2.2. Функциональная активность порообразующих белков наружной мембраны грамотрицательных бактерий
2.3. Пространственная структура поринов грамотрицательных бактерий
2.3.1. Методы изучения пространственной структуры белков
2.3.2. Пространственная организация молекул поринов
2.3.3. Построение теоретических моделей пространственной структуры ß-баррельных белков
2.4. Способы получения изолированных поринов
2.5. Конформационные переходы изолированных поринов
2.6. Антигенная структура порообразующих белков наружной мембраны граморицательных бактерий
2.6.1. Исследование антигенной структуры поринов иммунохимическими методами
2.6.2. Предсказание локализации антигенных детерминант
2.7. Регуляция экспрессии OmpF и ОтрС поринов грамотрицательных
Бактерий
2.8. Характеристика и свойства антигенов Yersinia ruckeri
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
3.1. Получение неспецифических (OmpF- и ОтрС- подобных) поринов наружной
мембраны Y. ruckeri
3.1.1. Первичная структура ОтрС- и OmpF поринов из Y. ruckeri
3.1.2. Анализ состава фракций пориновых белков наружной мембраны
Y. ruckeri, извлекаемых детергентами различной природы
3.1.2.1.Экстракция поринов неионным детергентом
октилполиоксиэти леном
3.1.2.2.Экстракция ионным детергентом SDS и очистка фракции

пориновых белков
3.1.3. Изучение влияния условий культивирования (осмолярности и температуры) на экспрессию OmpF и ОшрС-подобных поринов и их идентификация
3.1.4. Выделение индивидуальных OmpF и ОтрС поринов У. rucken
3.1.5. Технологичный способ получения и очистки OmpF порина Y rucken
3.2. Исследование функциональных свойств OmpF и ОтрС поринов
3.2.1. Характеристика проводимости одиночных каналов OmpF и ОтрС поринов из HM Y. ruckeri
3.2.2. Порообразующие свойства OmpF порина из HM Y, ruckeri
3.3. Молекулярная структура и пространственная организация OmpF и ОтрС поринов Y. ruckeri
3.3.1. Характеристика топологических моделей OmpF и ОтрС поринов Y.
ruckeri. Анализ их первичной и антигенной структуры
3.3.2. Сравнительный анализ пространственной структуры OmpF и ОтрС поринов Y ruckeri
3.3.3. 3D структура мономеров и тримеров OmpF и ОтрС поринов Y.
ruckeri
3.4. Изменения в пространственной структуре OmpF и ОтрС поринов
Y. ruckeri под действием температуры
3.4.1. Сравнительный анализ изменений в молекулярной структуре и микроокружении ароматических флуорофоров в молекулах OmpF и ОтрС поринов в процессе термоденатурации
3.4.2. Мониторинг изменений в пространственной структуре OmpF порина под действием температуры
3.5. Иммунологическая и иммунохимическая характеристика
OmpF порина Y. ruckeri
3.5.1. Иммуногенные и иммунохимические свойства OmpF порина Y.
ruckeri
3.5.2. Определение элементов антигенной структуры OmpF порина У.
ruckeri
3.5.2.1.Характеристика рекомбинантных мутантных белков OmpF порина из
НМ У. pseudotuberculosis
3.5.2.2.Элементы антигенной структуры OmpF порина У. ruckeri
3.6. Взаимодействие OmpF порина У. ruckeri с клетками эукариот

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
4.1. Материалы
4.2. Приборы и оборудование
4.3. Общие и аналитические методы исследования физико-химических характеристик поринов
4.4. ПЦР амплификация и секвенирование отрС и отрЬ генов
4.5. Получение изолированных поринов иерсиний
4.6. Спектроскопические методы исследования пространственной структуры поринов
4.7. Изучение порообразующей активности белка с помощью
техники БЛМ
4.8. Построение теоретических моделей поринов
4.9. Иммунохимические методы
4.10. Исследование взаимодействия поринов с клетками эукариот
5. ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

около 20-ти видов других пресноводных и морских рыб восприимчивы к данной инфекции. В связи с этим, ежегодно Y ruckeri является причиной больших экономических потерь в индустрии аквакультур. Инфекция распространяется среди рыб при прямом контакте с заражёнными особями или носителями. Кроме того, некоторое время бактерии могут оставаться жизнеспособными, находясь в водной среде. Из-за воспаления и точечных кровоизлияний внутри и вокруг ротовой полости, а также в нижнем отделе кишечника инфицированных рыб это кишечное заболевание известно как «болезнь красного рта» (ERM, enteric redmoth disease). При остром течении ERM у лососевых развивается сепсис, некроз и воспаление всех тканей.
Впервые ERM была обнаружена и описана в 1950-х годах в штате Айдахо (США) у радужной форели (Oncorhynchus mykiss) Rucker [140, 141] обнаружил, что часть особей рыб, находящихся в состояния носительства, выжили через 2 месяца после экспериментального заражения. Позже было доказано, что 25% популяции радужной форели при инфицировании могут переносить Y. ruckeri без заметных проявлений болезни. Передача возбудителя при прямом контакте особенно усиливается в стрессовых для рыб условиях. Так, факторами, способствующими возникновению и распространению заболевания, являются: ручные манипуляции с рыбой, неблагоприятные условия окружающей среды (дефицит кислорода, накопление органических веществ, увеличение количества аммиака), высокие показатели плотности посадки рыб. Hunter также установил [142], что носители передают Г. ruckeri здоровым рыбам при увеличении температуры до 25 градусов, в то время как при нормальных условиях, заражения не происходит.
Поскольку бактерии Y ruckeri обладают способностью выживать в водной среде, периодический сброс их вместе с испражнениями рыб играет важную роль в распространении болезни. Как и многие другие водные бактерии, возбудитель иерсиниоза может прикрепляться к различным поверхностям и донным отложениям. Coquet с соавторами [143] изолировали штамм способный формировать биоплёнки на твёрдых поверхностях, включая материалы, использующиеся для резервуаров на рыбных фермах. Было показано, что в процессе адгезии большую роль играют жгутики, использующиеся в процессе движения, связи бактерий друг с другом, а также формировании и росте колоний. Предполагается, что передача Y. ruckeri может происходить также через морских безпозвоночных и птиц [144]
Факторы условий внешней среды могут оказывать прямое влияние на патогенность микроорганизмов. Особенно это касается организмов обитающих в водной среде, поскольку в данном случае и микроорганизм, и организм хозяина сильно зависят от воздействия колебаний условий водного окружения. Altinok и Grizzle [145] доказали, что такие факторы как температура и солёность оказывают влияние на возникновение и степень тяжести инфекции,