Термическая стабильность коллагена в соединительных тканях

• Автор: Игнатьева, Наталия Юрьевна
• Шифр специальности: 02.00.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 301 с. : ил.

Содержание
Ведение
Глава 1. Основные компоненты и надмолекулярная организация соединительных тканей
1.1. Коллаген. Химический состав и иерархическая организация
1.2. Гликозаминогликаны, протеогликаны и протегликановые агрегаты
1.3. Взаимодействие коллагена и протеогликанов. Надмолекулярная организация матрикса
1.4. Физико-химическое описание денатурации коллагена
Глава 2. Методы контроля состояния матрикса соединительных тканей
2.1. Количественное определение основных компонентов соединительных ткани
2.1.1. Определение содержания коллагена
2.1.2. Определение содержания гликозаминогликанов
2.2. Протеолитические ферменты как зонды нативной конформации коллагена
2.3. Дифференциальная сканирующая калориметрия
2.4. ИК и КР спектроскопия
2.5. Многофотонная микроскопия с регистрацией генерации второй гармоники
2.6. Поляризационно-чувствительная оптическая когерентная томография
2.7. Сорбция паров воды биологическими объектами
2.8. Морфологический анализ с помощью световой и электронной микроскопии
2.9. Спекл-коррелометрия
Заключение к главе
Глава 3. Физико-химический анализ коллагена в соединительных тканях
3.1. Ткань связки надколенника
3.1.1. Денатурация коллагена в ткани связки
3.1.2. Влияние механического натяжения на термическую стабильность коллагена в системе с одноосной укладкой
3.2. Ткани глаза
3.2.1. Склера
3.2.1.1. Изменение физико-химических характеристик склеры в результате укрепляющего вмешательства
3.2.1.2. Стабилизация коллагена склеры глицериновым альдегидом
3.2.2. Теноновая капсула

3.3. Ткани межпозвонкового диска
3.3.1. Фиброзное кольцо
3.3.2. Пульпозное ядро
3.3.3. Замыкательцая пластина
3.4. Формообразующие хрящи
3.5. Мениск
Заключение к главе
Глава 4. Модификация соединительных тканей при неабляционном лазерном воздействии
4.1. Взаимодействие ИК лазерного излучения с биотканями. Особенности лазероиндуцированной модификации соединительных тканей
4.2. Измерение температурных полей в тканях
4.3. Устойчивость матрикса в условиях лазерного нагрева
4.3.1. Особенности лазеро-индуцированной модификации соединительных тканей на примере связки надколенника
4.3.2. Изменение коллагена в склере
4.3.3. Деградация матрикса в тканях межпозвонкового диска
4.3.3.1. Изменение коллагена фиброзного кольца
4.3.3.2. Денатурация коллагена пульпозного ядра
4.3.4. Модификация матрикса хрящевой ткани носовой перегородки
4.3.5. Модификация жировой ткани
Заключение к главе
Выводы
Благодарности
Список литературы
Список сокращений

Введение
Выявление взаимосвязи структуры и функции материала является общей естественнонаучной проблемой. При этом стабильность объекта, являясь, с одной стороны, характеристикой структуры, с другой - напрямую определяется его функцией. Таким образом, возникает триада функция - структура - стабильность. В этой триаде стабильность является понятием достаточно общим, включающим в себя устойчивость к термическому, механическому, химическому и другим воздействиям. Не умаляя значение остальных аспектов, отметим, что для физической химии термическая стабильность играет особую роль, гак как на основе именно этой характеристики мы определяем (или оцениваем) основные термодинамические функции (или их изменение) и, как следствие, используем аппарат термодинамики для описания состояния системы и ее изменения.
В определении физической химии как науки, «объясняющей на основании положений и опытов физики то, что происходит в смешанных телах при химических операциях» (М.В. Ломоносов), не содержится ограничений на выбор объекта физикохимического исследования. Однако мы понимаем, что строгое количественное описание в рамках общепризнанных моделей применяется для простых систем. Для сложных, многокомпонентных, многофазных объектов количественная характеристика затруднительна. Это не означает, что такие объекты не подчиняются основным физикохимическим законам. Первым этапом для описания сложных систем является выявление качественных закономерностей поведения и оценка самых общих термодинамических свойств, что дает возможность анализа структурно-функциональной связи в объекте. К таким свойствам относится термическая стабильность.
Соединительные ткани в организме выполняют одну функцию - механическую, но в разных вариантах: защита, опора, сочленение, объединение, передача нагрузки и прочее. Главным компонентом соединительных тканей является коллаген, который составляет треть от всех белков у млекопитающих. Все вариации надмолекулярной организации, архитектоники и функций соединительных тканей от твердой кости и прочной связки до прозрачной роговицы или гелеобразного пульпозного ядра определяются способом укладки этого белка и его взаимодействием с другими макромолекулами внеклеточного матрикса. Решение вопроса о том, как термическая стабильность коллагена отражает структуру и функцию ткани представляется, на наш взгляд, интересным аспектом освещения проблемы функция - структура - стабильность. Физико-химические исследования соединительных тканей в некоторой степени облегчаются тем, что доля клеток по массе и объему невелика (-10%), а большая часть представлена внеклеточным матриксом.

(двулучепреломления, количества поглощенного тепла и проч.). Определенные в рамках такого подхода для денатурации коллагена значения «энергия активации» «предэкспоненциальный фактор» варьируется от Еа=34 кДж/моль/А=105с"1 до Еа=858 кДж/моль/А = 10137с"' [114, 131]. В работе [134] для энергии активации получено значение 2062±30 кДж/моль. Столь значительный диапазон величин энергии активации заставляет усомниться в ценности определяемой величины и корректности используемого подхода.
В большинстве современных работ в качестве обоснования описания изменения измеряемых свойств коллагенсодержащего материала с ростом температуры согласно уравнению (2) цитируют работу Майлза и Джелашвили [106]. В ней авторы объяснили рост Т„ика эндотермы денатурации с уменьшением содержания воды уменьшением ДБ* из-за уменьшения числа допустимых конформаций для активированного комплекса (АК) в фибрилле, по сравнению с коллагеном в растворе, а также наличием поперечных сшивок между соседними молекулами. Справедливости ради надо сказать, что именно в этой работе для объяснения уменьшения числа допустимых конформаций макромолекулекул привлечена модель «полимер в трубке» Доя и Эдвардса [135]. Однако эта модель работает для. стабильных макромолекул в состоянии равновесия-в условиях ограничения для них свободного объема, но никак не для АК. Исторически первая статья Майлза на эту тему была опубликована в 1993 году [136]. В работе на основе оценки степени денатурации коллагена после выдерживания капсулы хрусталика.при температурах 47.4°С и 49.7°С в течение 21.4±2.9 мин были получены значения Ед=860 ± 44 кДж/моль, ЛН"=860 ± 44 кДж/моль и Д8*=2.38 ± 0.14 кДж/(моль‘К). Очевидно, что диапазон температур и,точность времени выдерживания заставляют усомниться в правомерности оценок.
Известные биохимики, авторы работ по структуре коллагена Энджел и Бачингер показали несостоятельность кинетической модели необратимой реакции 1 порядка на примере денатурации коллагена типа III [116]. Они, в очередной раз продемонстрировав обратимость процесса (см. рис. 26а), отметили, что для совпадения рассчитанной и экспериментальной температурной зависимости степени денатурации величина А должна составлять 1096-1097 сек'1 и Ед превышать 600 кДж/моль. Такие значения не имеют физического смысла, в том числе и потому, что Ед оказывается больше энергии разрыва химических связей и не соответствует энергии конформационных переходов и энергии водородных связей, разрушение которых и приводит к переходу спираль—»клубок.
В ответной статье Майлз и Бейли [137] приводят малообоснованную критику математических выкладок из работы Энджела и Бачингера и ссылки на экспериментальные данные для других белков с аналогичными значениями Еа и А. Что касается главпого аргумента, приведённого Энджелом и Бачингером, - обратимости