Ферментативное определение кофактора (ионов цинка) и ингибиторов алкогольдегидрогеназы из пекарских дрожжей

• Автор: Жмаева, Евгения Владимировна
• Шифр специальности: 02.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 223 с. : ил

Содержание

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. Структура и механизм действия алкогольдегидрогеназы

1.1. Общие сведения об алкогольдегидрогеназе

1.2. Структура алкогольдегидрогеназы из клеток пекарских дрожжей

1.3. Субстратная специфичность алкогольдегидрогеназы

1.4. Специфичность алкогольдегидрогеназы по отношению к коферменту

1.5. Кинетика и механизм действия алкогольдегидрогеназы

Глава 2. Ингибиторы алкогольдегидрогеназы из клеток пекарских дрожжей

2.1. Влияние ионов металлов на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы

2.2. Влияние комплексообразующих реагентов и аналогов никотинамид-адениндинуклеотида на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы
2.3. Влияние пиридиновых производных на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы
2.4. Влияние алкилирующих агентов на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы
2.5. Влияние лекарственных препаратов на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 3. Исходные вещества, посуда, аппаратура, методика эксперимента,
обработка результатов измерений
3.1. Исходные вещества
3.2. Посуда в аппаратура
3.3. Методика эксперимента
3.4. Обработка результатов измерений
Глава 4 Выбор фермента и индикаторной реакции
Глава 5. Влияние органических соединений на каталитическую активность
алкогольдегидрогеназы
5.1. Влияние серо- и фосфорсодержащих органических соединений на
каталитическую активность алкогольдегидрогеназы
5.1.1. Определение пестицидов по их ингибирующему действию на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы
5.2. Влияние азотсодержащих органических соединений на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы
5.2.1. Изучение типа ингибирования алкогольдегидрогеназы 2,2’-дипиридилом
5.2.2. Возможные причины влияния азотсодержащих гетероциклических органических соединений на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы
5.2.3. Определение азотсодержащих гетероциклических соединений с использованием алкогольдегидрогеназы
5.2.4. Определение азотсодержащих гетероциклических соединений в присутствии ртути(П) и серебра(1)
5.2.5. Определение ноотропила и кетотифена с использованием алкогольдегидрогеназы
5.3. Влияние аминокислот на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы
5.3.1. Изучение типа ингибирования алкогольдегидрогеназы триптофаном
Глава 6. Ферментативный метод определения цинка(П) по реактивации
апофермента алкогольдегидрогеназы
6.1. Влияние ионов металлов на каталитическую активность нативной
алкогольдегидрогеназы
6.2. Выбор условий получения апофермента алкогольдегидрогеназы
6.3. Влияние Zn(II) на нативную алкогольдегидрогеназу в оптимальных условиях получения псевдоапофермента
6,4 Влияние Zn(ll) на псевдоапоферменты алкогольдегидрогеназы,
полученные с использованием 1,2,3-бензотриазола, 1,10-фенантролина, ЭДТА
6.5. Влияние ионов металлов на псевдоапоферменты алкогольдегидро-
геназы
6.6. Получение истинного апофермента алкогольдегидрогеназы
6.6.1. Получение апофермента алкогольдегидрогеназы с использованием 1,2,3-бензотриазола
6.6.2. Получение апофермента алкогольдегидрогеназы с использованием 1,10-фенантролина и ЭДТА
Глава 7. Определение ионов металлов по их ингибирующему влиянию на
алкогольдегидрогеназу
Глава 8. Влияние метилртути на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы
8.1. Определение метилртути по ее ингибирующему действию на
алкогольдегидрогеназу
8.2. Изучение типа ингибирования алкогольдегидрогеназы ионами ртути(П) и метилртутью
8.3. Определение метилртути в присутствии Hg(II)
Глава 9. Определение ртути(Н), метилртути и цинка(П) в различных объектах
9.1. Определение ртути(П) в водах
9.2. Определение метилртути в водах
9.3. Определение цинка(П) в крови человека по реактивации апофермента алкогольдегидрогеназы
9.4. Определение цинка(П) в крови человека по его ингибирующему действию на алкогольдегидрогеназу
Глава 10. Иммобилизация алкогольдегидрогеназы
10.1. Выбор индикаторной системы для контроля активности иммобилизованной алкогольдегидрогеназы
10.2. Выбор носителей для иммобилизация алкогольдегидрогеназы
10.3. Выбор способа иммобилизация алкогольдегидрогеназы
10.3.1. Иммобилизация алкогольдегидрогеназы путем адсорбции ее на поверхности силикагеля
10.3.2. Тест-методика определения метилртути с использованием алкогольдегидрогеназы, иммобилизованной на силикагеле
10.3.3. Тест-определение цинка(П) с применением алкогольдегидрогеназы, физически иммобилизованной на силикагеле
10.4. Ковалентная иммобилизация алкогольдегидрогеназы
10.4.1. Тест-методика определения метилртути с использованием алкогольдегидрогеназы, ковалентно иммобилизованной в альбумине
ВЫВОДЫ
СИИСКОК ЛИТЕРАТУРЫ
Схема 4 [25].
Неупорядоченный мехнизм действия АДГ
Для подтверждения правильности этого механизма был использован ингибитор АДГ — пиразол, который образовывал тройной комплекс с НАД+ и ферментом, а со свободным ферментом не связывался. Полученные результаты позволили сделать следующие выводы:
1) равновесие между двойными и тройными комплексами устанавливается
медленно;
2) зависимость скорости реакции от концентрации НАД+ обусловлена образованием НАД1 в результате диссоциации тройного комплекса {фермент-НАД+-этанол}; при насыщающей концентрации субстрата диссоциация НАД+является скорость лимитирующей стадией;
3) все кинетические константы, за исключением констант диссоциации комплексов с ферментом с образованием НАД+ и НАДН, зависят от структуры субстрата.
В опытах Фишера [41] в качестве субстрата АДГ был использован этанол, меченый дейтерием по первому углеродному атому (СН3СД2ОН). Протекающая при этом реакция может быть представлена схемой 6. В этих опытах кофермент был выделен в восстановленной форме. При этом было обнаружено, что при восстановлении НАД+ 1,1-дейтероэтанолом образуется новый асимметричный центр, находящийся у 6 углеродного атома дигидропиридинового кольца кофермента.