Повышение эффективности лазерной флуоресцентной диагностики объектов микробной природы

• Автор: Васильев, Евгений Николаевич
• Шифр специальности: 01.04.21
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 107 с. : ил.

Оглавление
Актуальность
Цель и задачи работы
Защищаемые положения
1 Глава 1. Введение во флуоресцентную диагностику
1.1 Природа флуоресценции
1.2 Методы регистрации флуоресценции и принципы соответствующей целевой аппаратуры
1.3 Методы диагностики на основе регистрации флуоресценции природных флуорофоров для биологи и медицины
1.4 Методы диагностики на основе экзогенной флуоресценции
1.5 Методы обработки результатов ЛФД
1.6 Диагностика объектов микробной природы, состояние проблемы и возможные пути ее решения на основе ЛФД
2 Глава 2. Экспериментально-теоретическое исследование. Материалы и методы
2.1 Проблемная база для выполнения работы
2.2 Аппаратура спектральной лазерной флуоресцентной диагностики
2.3 Особенности флуоресценции биологических субстратов с микроорганизмами
2.4 Модель распознавания спектральных флуоресцентных данных и метод ее математического решения
2.5 Практическое и теоретическое планирование эксперимента по накоплению базы данных эталонных образцов для решения задачи распознавания
2.6 Восстановление корректных спектров с учетом характеристик оптической экстинкции вещества
3 Глава 3. Наработка базы данных и исследование спектральных характеристик различных микобактерий для дифференциальной флуоресцентной диагностики
3.1 Измерения и обработка спектров флуоресценции
3.2 Индивидуальные особенности микробов
3.3 Разработка модели с учетом корректировки спектральных данных с помощью спектров экстинкции исследуемых веществ
4 Глава 4. Применение детергента для повышения чувствительности дифференциальной лазерной флуоресцентной диагностики микроорганизмов.

4.1 Механизм увеличения интенсивности флуоресценции под действием детергента
4.2 Измерение флуоресценции микроорганизмов под влиянием различных детергентов и определение динамики
4.3 Анализ специфичности флуоресценции микобактерий при их обработке с использованием мирамистина
5 Глава 5. Диагностика заболеваний туберкулеза по измерению флуоресценции плазмы крови
5.1 Схема распознавания и классификации болезни
5.2 Сбор и организация данных лазерно-флуоресцентной диагностики

5.3 Экспериментальная установка и процедура тестирования
5.4 Результаты исследования
Выводы работы
Научная новизна и практическая значимость
Список литературы

Актуальность
Возникновение флуоресцентного анализа и диагностики с применением лазеров привело к созданию эффективных методов дистанционного и бесконтактного исследования различных субстратов органического происхождения с достижением большой чувствительности метода. Качество диагностики в этом случае во многом обусловлено временной и пространственной когерентностью возбуждающего излучения. Лазерно-индуцированная флуоресценция (ЛИФ) успешно применяется при определении участков загрязнения нефтепродуктами, в том числе аварийного состояния нефтепроводов (технология LDI). В таможенных службах используются приборы ЛИФ для определения наличия наркотиков (NarTestO). В медицине ЛИФ применяется в качестве диагностического средства при фотодинамической терапии онкологических заболеваний. Основная задача, решение которой позволит увеличить возможности этих и подобных методов, заключается в разделении компонентных вкладов во флуоресцентный сигнал от многокомпонентной смеси сложных многоатомных молекул.
В связи с прогрессом в лазерных методах лечения заболеваний, связанных с микробной флорой, что привело к существенному сокращению сроков лечения, возникла острая необходимость в экспрессных методах диагностики заболеваний. Это необходимо по двум причинам. Первая — лекарственная терапия сильнодействующими препаратами в избыточных дозах приводит к ухудшению состояния жизненноважных органов. Поэтому необходимо, вовремя определить момент прекращения лекарственной терапии. Вторая - в процессе лечения очень важно отслеживать динамику лечения для его коррекции. Существующие методы диагностики, основанные на микробиологическом анализе, требуют длительного времени для установления диагноза (например, диагностика туберкулеза занимает от 3-х до 6-ти недель.)
Развитие новых методов диагностики на основе исследования характеристик конверсии (рассеяние, флуоресценция, римановский и нелинейный эффекты и т.п.) лазерного излучения в биологическом веществе имеет проблемный и приоритетный характер в целях диагностики для медицины, и кроме нее также для биологии, промышленности и т.д., поскольку эти методы являются прямой базой новой экспресс - диагностики, которая лишена ряда недостатков остальных способов и имеет неоспоримые преимущества. Из них лазерная флуоресцентная диагностика может сочетать в себе приемлемые для задач диагностики чувствительность и специфичность. Однако сейчас наиболее часто флуоресцентный метод применяется с использованием специфических флуоресцирующих веществ, которые связываются с иммунными телами, специфическими к своему типу микроорганизмов [1,2]. Это связано с тем, что сама по себе эндогенная флуоресценция трудно поддается специфическому анализу. Но все-таки были разработаны методы диагностики для некоторых чистых культур [3].

микроорганизмов. Преимущества и недостатки хромато — масс — спектрометрического анализа и газо- жидкостной хроматографии одинаковы и по тем же критериям это вызывает трудности в их использовании в практической клинической диагностике.
Современное состояние лабораторной и клинической диагностики микробных инфекций может быть улучшено при постоянном поиске и нахождении новых сравнительно простых, дешевых и информативных экспресс методов индикации микроорганизмов, а также мониторинга состояния микрофлоры человека и продуктов ее жизнедеятельности в клинической практике, лишенных вышеперечисленных недостатков микробиологического и других методов исследования, что оправдано и в некоторых случаях необходимо.
Поскольку все микробы обладают заметной эндогенной флуоресценцией, существует принципиальная возможность индикации и идентификации субстратов, населенных микробами. В работе [65] показано присутствие изначальной специфичности флуоресцентных показателей отдельных нативных микробов в чистых культурах. Однако на практике многие микробиоценозы представляют собой ассоциации микробов, число разнообразных видов в которых может достигать более 103. В связи с этими обстоятельствами актуальным является поиск и разработка нового метода флуоресцентной диагностики, позволяющего проводить
дифференцированную идентификацию отдельных видов в микст-сисемах. При этом метод должен обеспечить оптимальное соотношение между качеством диагностики и ее скоростью, что может быть достигнуто аппаратными и методологическим решениями. Например, использованием предварительно концентрирующих жидкости технологий.
Заключение. На основе изучения литературы можно сказать, что флуоресцентный метод диагностики биологических объектов имеет объективные возможности для идентификации и дифференциации этих объектов. Однако использование ЛФД наталкивается на одну существенную проблему, проявляющуюся в отсутствии или недостатке универсальных методов специфической обработки спектральных данных. Особенно это касается диагностики микроорганизмов: существующие нефлуоресцентные методы не обеспечивают достаточной скорости и неинвазивности диагностики, а метод ЛФД не был развит для видовой дифференциальной диагностики. Существующие методы обработки данных ЛФД микроорганизмов являются частными, узконаправленными, по отношению к проблематике. Было выяснено, что перспективными для этого методами являются метод искусственных нейронных сетей и более устойчивые к шумам статистические регрессионные методы.