Лазерная спектроскопия компонентов светоиндуцируемой ферментативной реакции

• Автор: Лебеденко, Степан Игоревич
• Шифр специальности: 01.04.21
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 113 с. : ил.

ГЛАВА 1. КОЛЕБАТЕЛЬНАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ БЕЛКОВ И ОПТИЧЕСКОЕ УПРАВЛЕНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИЕЙ (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР)

1.1 Спектроскопия комбинационного рассеяния света и спектроскопия оптического

эффекта Керра, индуцированного комбинационным резонансом

1.1.1 Основы спектроскопии комбинационного рассеяния света

1.1.2 Основы RIKES

1.2 Светоиндуцируемая ферментативная реакция

1.2.1 Строение и функции белков

1.2.2 Ферментативная реакция

1.3 Спектроскопия биомолекул

1.3.1 Спектроскопия поглощения и флуоресценции белков

1.3.2 КР спектроскопия белковых молекул

Заключение к главе
ГЛАВА 2. МЕТОДИКА ПОЛУЧЕНИЯ И ОБРАБОТКИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ДАННЫХ
2.1 Эксперименталы !АЯ установка для измерения КР спектров и изучения динамики
широкополосного фона
2.1.1 Особенности измерения и обработки КР спектров и характеристик широкополосного
фона
2.1.2 Особенности измерения и обработки низкочастотных КР спектров и спектров RIKES
2.2 Экспериментальная установка для измерения спектров поглощения и лазерного
приготовления субстрата-регулятора светоиндуцируемой ферментативной реакции
2.3 Особенности приготовления образцов
2.4 Методы вычитания фонового сигнала из КР спектров
2.5 Д(у)-представление
2.6 Методика сравнения КР спектров
ГЛАВА 3. ОСОБЕННОСТИ ШИРОКОПОЛОСНОГО ФОНА В КР СПЕКТРАХ БИОМОЛЕКУЛ

3.1 Зависимость параметров широкополосного фона от молекулярной массы белка
3.2 Влияние видимого лазерного излучения на структуру биополимеров по данным КР
спектроскопии
3.3 Зависимость параметров широкополосного фона от конформационного состояния
биомолекул

3.4 Сравнение кинетик фотообесцвечивания различных биополимеров
3.5 Осцилляции интенсивности широкополосного фона во времени
3.6 Заключение к главе
ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ РАСТВОРИТЕЛЯ НА НИЗКОЧАСТОТНЫЕ КОЛЕБАТЕЛЬНЫЕ
РЕЗОНАНСЫ В БЕЛКАХ И МОДЕЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВАХ ПО ДАННЫМ ЛАЗЕРНОЙ КР СПЕКТРОСКОПИИ И ЫКЕБ
4.1 ИКЕБ водного раствора белка и модельного вещества
4.2 Влияние растворителя на высокочастотные колебательные резонансы модельных
ВЕЩЕСТВ
4.2.1 КР спектры смесей модельных веществ в диапазоне СН валентных колебаний
4.2.2 КР спектры смесей модельных веществ в диапазоне СН изгибных и крутильных
колебаний
4.3 Сдвиг частоты НЧ колебательных резонансов под ДЕЙСТВИЕМ растворителя
4.4 Уширение линии НЧ колебательного резонанса под ДЕЙСТВИЕМ растворителя
4.5 Изменение формы НЧ колебательного резонанса под действием растворителя
4.6 Теоретическая оценка влияния растворителя на низкочастотные колебательные
резонансы модельных веществ
4.7 Заключение к Главе
ГЛАВА 5. ЛАЗЕРНО-ОПТИЧЕСКОЕ ПРИГОТОВЛЕНИЕ СВЕТОЧУВСТВИТЕЛЬНОГО СУБСТРАТА-РЕГУЛЯТОРА СВЕТОИНДУЦИРУЕМОЙ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ
5.1 Идентификация компонентов раствора субстрата
5.1.1 Спектры поглощения
5.1.2 Результаты исследований состава растворов субстрата методом ЯМР
5.1.3 Результаты жидкостной хроматографии
5.2 Определение оптимальных доз облучения
5.3 КР спектры компонентов модельной системы ферментативной РЕАКЦИИ
5.4 Заключение к Главе
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Знания о строении ферментов, их динамических свойствах, фермент-субстратных взаимодействиях и других аспектах молекулярных механизмов функционирования ферментативных систем чрезвычайно актуальны. Лазерная спектроскопия, в частности лазерная спектроскопия комбинационного рассеяния (КР), является одним из наиболее информативных методов изучения конформационного состояния биомолекул.
Важное место в современных исследованиях белков занимает разработка и применение кинетических методов, позволяющих изучать динамику функционирования ферментативных систем в реальном времени и с высоким разрешением. Основным подходами на сегодняшний день являются методы остановленного потока (stopped-flow), постоянного потока (constant-flow), метод гашения реакции (quenched-flow) и метода фотоуправления (метод вспышки, flash method). Разработанный в начале 1950-х метод вспышки является, пожалуй, наиболее эффективным способом управления ферментативной реакцией. В то же время ферментативная активность большинства белков-ферментов не поддаётся фотоуправлению напрямую. В начале 1970-х был предложен метод управления активностью фермента с помощью фоточувствительного субстрата-регулятора, однако процесс фотоуправления субстратом, его промежуточные состояния и эффективность преобразования субстрата-регулятора в необходимую форму до сих пор практически не исследованы. Поэтому одной из важнейших и актуальных задач является разработка метода лазерной подготовки субстрата-регулятора для реализации светоиндуцируемой ферментативной реакции.
Обработка КР спектров многих веществ, особенно биомолекул, осложняется наличием в них широкополосного фона. Интенсивность фона, как правило, на несколько порядков превосходит интенсивность КР линий исследуемого вещества. Несмотря на то, что эта проблема возникла в первых работах по КР спектроскопии, а ежегодно этому методу посвящается большое число работ, до сих пор единой точки зрения на природу этого явления не существует. В первую очередь, это

В соответствии с распределением Больцмана для равновесной заселенности энергетических уровней
IJojj/Ic(ù)) = exp(-hoj/kT), (2.4)
где h - постоянная Планка, Т - абсолютная температура, к - постоянная Больцмана. Отсюда, для R(a>) получаем:
R(a)~co[l-exp(-hû)/kT)]Ic(a). (2.5)
Принимая во внимание, что в написанных выше выражениях для интенсивностей, нужно учесть зависимость интенсивности рассеянного света от четвертой степени частоты [6], и полагая значение константы равным 1 (поскольку рассматриваются относительные значения интенсивностей), получим искомое R(v j-представление:
R(y) = (vL -r)~V[l-exp(hcv/kT)]Ic(v), (2.7)
где Ic{v) - интенсивность стоксового компонента КР (регистрируемая спектрометром), v - отстройка частоты, отсчитываемая от лазерной линии в см'1, vL - частота возбуждающего лазерного излучения в см'1, Т - абсолютная температура, с - скорость света в вакууме.
Такое преобразование переводит фон упругого рассеяния, который имеет лоренцеву форму линии, в плато, слегка уменьшающееся по интенсивности в НЧ области. Данное представление позволяет анализировать спектральные кривые, сравнивая относительное изменение интенсивностей колебательных резонансов на фоне практически постоянного уровня сигнала, не являющегося непосредственно КР спектром.
2.6 Методика сравнения КР спектров
В КР спектроскопии часто возникает задача сравнения спектров. Это может быть проверка воспроизводимости результатов измерений, сравнение КР спектров различных веществ, сравнение экспериментальных данных с литературными