Лазерная флуориметрия ансамблей локализованных донорно-акцепторных пар : на примере белков

• Автор: Банишев, Александр Александрович
• Шифр специальности: 01.04.21
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 125 с. : ил.

Принятые сокращения
Глава I. Объекты с локализованными донорно-акцепторными (ЛДА) парами
и их флуоресцентные свойства (обзор литературы)
1.1 Некоторые объекты с ЛДА парой
1.1.1 Основные типы объектов с ЛДА парой
1.1.2 Применение искусственно созданных объектов с ЛДА парой
1.1.3 Перспективы использования белков как объектов с ЛДА парой
1.2 Собственная флуоресценция белковых молекул
1.2.1 Общие сведения о собственной флуоресценции белков
1.2.2 Структура и спектральные свойства сывороточного альбумина человека (однотриптофановый белок) и бычьего сывороточного альбумина (двухтриптофановый белок)
1.2.3 Фотохимические реакции триптофана и триптофан-содержащих белков
1.3 Флуоресцентные белки
1.3.1. Общие сведения о флуоресцентных белках (на примере зеленного - ОР'Р и красного - ОлЯвс! флуоресцентного белка)
1.3.2 Посттраисляционные формы флуоресцентных белков
1.3.3 Мономерный аналог белка ОлКеё - белок тРРР1. Получение новых мутантов шЛИР!
Глава II. Определение фотофизических параметров ЛДА пар сложных органических соединений (теория)
2.1 Модель фотофизических процессов в сложных органических соединениях
2.2 Модель фотофизических процессов в ансамбле молекул с ЛДА парой
2.3. Нелинейная и наносекундная кинетическая флуориметрия ЛДА пар
Глава III. Определение фотофизических параметров
флуорофоров/хромофоров в ЛДА парах (эксперимент)
3.1 Экспериментальная техника
3.1.1 Наносекундный лазерный флуориметр/флорометр
3.1.2 Классические спектральные измерения
3.2 Определение фотофизических параметров триптофана в водном растворе
3.2.1 Анализ спектров поглощения и флуоресценции
3.2.2 Анализ кривых насыщения и кинетических кривых
3.3 Определение фотофизических параметров триптофан-содержащих белков (на примере человеческого и бычьего сывороточного альбумина) в водном растворе
3.3.1 Анализ спектров поглощения и флуоресценции
3.3.2 Анализ кинетических кривых и кривых насыщения
3.4 Определение фотофизических параметров подансамблей ЛДА пар на примере белка тШ?Р1
3.4.1 Анализ спектров поглощения, флуоресценгщи и возбуждения флуоресценции ансамбля молекул белка тКЛР1
3.4.2 Анализ воздействия лазерного излучения на ансамбль молекул белка тРРР!
3.4.3 Определение концентраций и индивидуальных фотофизических параметров хромофора белка тЯРР1
3.4.4 Определение концентраций и фотофизических параметров флуоресцирующего хромофора белков тИРР1/0668 и т11РР1/066С (мутанты белка тРРР!)
3.4.5 Перенос энергии в ЛДА парах подансамблей белка т!1РР1
Заключение
Список литературы

Принятые сокращения
В - Blue form, синяя форма хромофора (белка);
FRET - Fluorescence Resonance Energy Transfer;
GFP - Green Fluorescent Protein;
G - Green form, зеленая форма хромофора (белка); mRFP 1 — monomeric Red Fluorescent Protein;
R - Red form, красная форма хромофора (белка);
Trp - триптофан;
А - акцептор;
БСА - бычий сывороточный альбумин Д - донор;
ДА пара - донорно-акцепторная пара;
ЛДА пара - локализованная донорно-акцепторная пара; ОМА - оптический многоканальный анализатор;
КР - комбинационное рассеяние;
САЧ - сывороточный альбумин человека;
СОС - сложное органическое соединение;
ФБ - флуоресцентный белок.

Флуоресцентная спектроскопия (флуориметрия) широко используется в исследованиях сложных органических соединений (красителей, белков, фотосинтезирующих организмов, нефтяных углеводородов и т.д.)- Однако традиционные (линейные) методы флуоресцентной спектроскопии обладают ограниченными информационными возможностями в анализе флуоресцирующих объектов из-за низкой избирательности (полосы флуоресценции большинства органических соединений при комнатной температуре широкие и бесструктурные [1]), поэтому данных, получаемых этими методами, зачастую недостаточно для понимания структурной организации и диагностики сложного органического соединения (СОС). Задача диагностики СОС заметно усложняется, если макромолекула СОС содержит более одного флуорофора.
Интересным и важным для практического применения подклассом многофлуорофорных систем являются молекулярные объекты с локализованной донорно-акцепторной (ЛДА) парой - макромолекулы, содержащие единичную пару флуорофоров, между которыми возможен перенос энергии возбуждения. Объекты подобного рода играют большую роль в получении информации о внутреннем состоянии макромолекул СОС: их пространственной организации, размерах [2], состоянии микроокружения [1] и т.д., а также изменении этих характеристик при различных внешних воздействиях [3]. В частности, искусственно созданные системы, состоящие из пары красителей (меток), закрепленных на концах исследуемой молекулы СОС, лежат в основе так называемой «спектроскопической линейки» [4], используемой для измерения расстояний в молекулах, и, как следствие, для наблюдения изменения конформаций, например, в белках [5], ДНК [6], полимерах [7]. К объектам с ЛДА парой можно также отнести искусственно синтезированные бифлуорофорные красители [8].
Особый интерес представляют природные объекты, в которых ЛДА парами являются их собственные флуорофоры. В этом случае не возникает проблем, свойственных искусственно созданным донорно-акцепторным (ДА) парам: неизменность структуры исследуемой молекулы при введении меток, стабильность комплекса молекула-метка и г.д. К числу таких объектов относятся многие типы белков. Их удобно использовать в качестве модельных объектов, содержащих локализованную пару флуорофоров. Но белки представляют и самостоятельный интерес как неотъемлемые компоненты живых систем, обладающие к тому же свойством флуоресцировать, что открывает возможность использования белков в качестве индикаторов процессов в живых системах.

в одном из четырех состояний, которые мы назвали коллективными-, каждое из них одновременно отражает как состояние донора, так и состояние акцептора:
Состояние 1 - донор и акцептор молекулы находятся в состоянии Sod и Sqa -концентрацию таких молекул будем обозначать n3 = n, (t,T);
Состояние 2 - донор молекулы находится в состоянии Si о, а ее акцептор в Sqa -концентрацию таких молекул будем обозначать п2 = n2(t,r);
Состояние 3 - донор молекулы находится в состоянии Sod, а ее акцептор в SiA -концентрацию таких молекул будем обозначать n3 = n3 (t,У);
Состояние 4 - донор и акцептор молекулы находятся в состоянии Sm и SiA -концентрацию таких молекул будем обозначать n4 = n4(t,?);
Динамика изменения концентраций приведенных выше четырех коллективных состояний ЛДА пары математически описывается следующей системой кинетических уравнений (для начала, в пренебрежении переносом с возбужденного донора на
возбужденный акцептор):
Зпт w ч / п, пз
—= -F(t,f) ■ (aD + стд) ■ п, + -§■ + -j-dt т3 т3
~ХГ = _F(t,T) • aA ■ п2 g--KDA ■ n2 + F(t,F) aD -n,
St x3 x3
■ 5^3~ - -F(t, T) • aD ■ n3 -Щ--+ F(t, ?) ■ aA • n, + Ц- + KDA • n2 (2.9)
St т3 t3
^- = F(t,T)-aA-n2 + F(t,F)-aD-n3-^--^
St т3 t3
n, +n2 +n3 +n4 =n0,
где, символы D и А относятся к донору и акцептору соответственно; an - сечение поглощения донора; сгА - сечение поглощения акцептора, соответствующее переходу So—>Si; Kda - скорость переноса энергии с возбужденного донора на невозбужденный акцептор; по - полная концентрация молекул содержащих ЛДА пару.
Таким образом, условия, накладываемые на модель формирования флуоресцентного отклика ансамбля ЛДА пар, могут быть учтены' через введение коллективных состояний ЛДА пары (состояние ЛДА пары, которое одновременно отражает состояние донора и акцептора). В результате мы приходим не к раздельному описанию флуоресцентного отклика каждого подансамбля молекул донора и акцептора, как того требует традиционный формализм (составление систем кинетических уравнений