Лазерная диагностика функционально-значимой динамики белковых молекул

• Автор: Чикишев, Андрей Юрьевич
• Шифр специальности: 01.04.21
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 333 с. : ил.

Содержание
Введение
Глава 1. Лазерная спектроскопия структуры белковых молекул 1 Л. Особенности структуры белковых молекул

1.2. Особенности структуры и функционирования химотрипсина и люциферазы.

1.3. Методы лазерной физики в исследованиях белковых молекул 1.3Л. Флуоресцентная спектроскопия с временным разрешением

1.3.2. Спектроскопия комбинационного рассеяния света

1.3.3. Нелинейная лазерная спектроскопия Литература

Глава 2. Многофункциональный лазерный спектрометр для исследования биомолекул

2.1. Лазерные источники

2.2. Оптическая схема МЛС.

2.2.1. Оптическая схема экспериментов по флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением.
2.2.2. Оптическая схема экспериментов по КР спектроскопии
2.2.3. Оптическая схема экспериментов по микроспектроскопии
2.3. Оптимизация оптической схемы конфокального микроскопа
2.3.1. Элементы дифракционной теории построения изображения в конфокальном микроскопе
2.3.2. Определение параметров оптической схемы
2.4. Системы регистрации
2.4.1. Система счета фотонов с временным разрешением
2.4.2. Многоканальное детектирование КР спектров
2.4.3. Система регистрации на основе позиционно-чувствительного ФЭУ МКП
2.5. Методика обработки экспериментальных данных
2.5.1. Обработка кинетик затухания интенсивности флуоресценции
2.5.2. Обработка данных флуоресцентной спектрохронографии
2.5.3. Коррекция стационарных спектров флуоресценции
2.5.4. Обработка спектров комбинационного рассеяния
2.6. Воздействие лазерного излучения на образцы Заключение к главе
Литература
Глава 3. Примеры применения МЛС для диагностики биообъектов
3.1. КР спектроскопия нефлуоресцирующих фталоцианинов в растворах, модельных средах и клетках
3.2. Флуоресцентная спектрохронография белка мелиттина
3.3. Флуоресцентная спектроскопия при двухфотонном возбуждении
3.4. Определение параметров широкополосного фона в КР спектрах белковых молекул

Заключение к главе 3
Литература
Г лава 4. КАРС спектроскопия как метод диагностики структуры белковых
молекул
4.1. Особенности КАРС спектроскопии белковых молекул
4.2. Техника КАРС спектроскопии
4.3. КАРС спектроскопии белковых молекул
4.3.1. КАРС спектроскопия имидазольного кольца
4.3.2. КАРС спектроскопия ароматических аминокислотных остатков
4.3.3. КАРС спектроскопия полосы амид I
4.3.4. КАРС спектроскопия полосы амид III
4.3.5. Невырожденный КАРС растворов аминокислот
Заключение к главе 4
Литература
Глава 5. Колебательная спектроскопия функционально-значимых структурных
изменений белковых молекул
5.1. Определение изменения структуры фермента при его взаимодействии с 224 лигандом
5.1.1. Изменения полосы амид I
5.1.2. Изменения полосы амид III
5.1.3. Изменения полос ароматических аминокислотных остатков
5.1.4. Изменения полос дисульфидных мостиков
5.2. Конформационные изменения белков при переходе от кристаллического 240 состояния к раствору: сравнение данных рентгеноструктурного анализа и КР спектроскопии
5.3. Структурные изменения химотрилсина, связанные с эффектом "инверсии 252 функции"
Заключение к главе 5
Литература
Глава 6. Светоиндуцированные конформационные изменения в
биолюминесцентной системе люциферин-люцифераза
6.1. Спектральные свойства компонент биолюминесцентной системы
6.2. Тушение флуоресценции люциферазы при взаимодействии с лигандами
6.2.1. Взаимодействие люциферазы с люциферином
6.2.2. Взаимодействие люциферазы с АТФ
6.3. Фотоиндуцированные изменения молекулы люциферина.
6.4. Внутримолекулярная динамика люциферазы
6.5. Эффект фотоиндуцированного разгорания флуоресценции люциферазы
6.6. Схема фотоиндуцированных конформационных изменений
Заключение к главе 6
Литература
Заключение
Введение
Методы лазерной физики обеспечивают уникальный инструментарий, при помощи которого исследователи самых разных областей научного знания получают не просто новую, но принципиально недоступную в долазерную эру информацию о структуре и свойствах объектов различной природы. Без сомнения, едва ли не самые впечатляющие успехи современной лазерной физики связаны с исследованиями, проводимыми в области наук о жизни. Желание раскрыть фундаментальные закономерности процессов, происходящих в живой природе, заставляет обращаться к исследованиям на молекулярной уровне. Здесь же основное внимание оказывается сконцентрированным на белках - молекулах, обеспечивающих реализацию практически всех жизненно важных процессов. Последние являются процессами принципиально динамическими, поэтому для их исследования необходимы методы, высокая информативность которых дополняется возможностью регистрации изменений в реальном времени. Методы лазерной физики безусловно удовлетворяют этим требованиям.
Следует особо отметить то обстоятельство, что применение лазеров не только революционизировало традиционные ("долазерные") методы исследования, такие, например, как флуоресцентная и абсорбционная спектроскопия и спектроскопия комбинационного рассеяния света, но и дало возможность реализовать принципиально новые методы оптической спектроскопии, основанные на нелинейно-оптических эффектах. Нелинейно-оптические методы, хорошо зарекомендовавшие себя в исследованиях сравнительно простых веществ, должны быть опробованы и в экспериментах с объектами биологической природы.
Поглощение кванта света биомолекулой само по себе может являться первопричиной целой цепочки сложнейших изменений, включающих как элементарные физические, так и биохимические процессы. Хорошо известны две природные системы, "запускаемые" светом. Это фотосинтетическая система растений и система зрительного восприятия. Свидетельством впечатляющих успехов оптических методов в их изучении являются десятки монографий и специализированные научные конференции соответствующей проблематики.

определяется пуассоновской статистикой, что облегчает проведение тщательного анализа данных. Временное разрешение метода является довольно высоким, однако разрешение порядка 2-3 пс является предельным и не может быть существенно улучшено. Метод является очень чувствительным и дает возможность работать с возбуждающими импульсами сравнительно невысокой интенсивности, что позволяет избежать нелинейных эффектов в сложных образцах и разрушения биологических молекул. Время измерения кинетики затухания занимает порядка десятков минут, что приемлемо, однако существуют методы, требующие гораздо меньшего времени для накопления данных. Таким образом, метод счета фотонов обладает неоспоримыми преимуществами и практически не имеет существенных недостатков, за исключением высокой стоимости используемой аппаратуры, которая главным образом зависит от требуемого временного разрешения. Поэтому в настоящее время он наиболее широко используется для измерения кинетик затухания в области физической химии, биологии, биофизики.
Идея метода, основанного на использовании стрик-камеры. состоит в том, чтобы задачу временного разрешения превратить в задачу пространственного разрешения. Принцип действия стрик-камеры основан на ускорении и отклонении фотоэлектронов, испущенных с катода, при помощи пары отклоняющих пластин. К пластинам приложено напряжение, промодулированное синхронно с частотой повторения возбуждающих импульсов. Отклоняемые электроны ударяются о фосфоресцирующую пластину, расположенную в противоположном от катода конце камеры. Определенная позиция на пластине соответствует определенной задержке фотона относительно возбуждающего импульса. Свечение
регистрируется ПЗС-камерой с усилителем яркости. Стрик-камера осуществляет временную развертку по одной пространственной координате, при этом вторая пространственная координата может использоваться для развертки по длине волны флуоресценции, что фактически дает возможность наблюдать эволюцию
флуоресцентных спектров во времени.
Современные стрик-камеры имеют аппаратную функцию порядка 1 пс, что на порядок лучше, чем в обычной системе счета фотонов [45]. Поэтому, если требуется высокое временное разрешение и относительно высокая
чувствительность в сочетании с возможностью одновременной регистрации