УФ-лазерная агрегация водорастворимых белков

• Автор: Челноков, Евгений Владимирович
• Шифр специальности: 01.04.21
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Нижний Новгород
• Количество страниц: 120 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

Цель диссертационной работы:

Научная новизна работы:

Научно-практическая значимость

ГЛАВА 1. Экспериментальное исследование агрегации водорастворимых белков при воздействии УФ-лазерного излучения различных длин волн

1.1 Выбор исследуемой среды и длины волны излучения

1.1.1 Материалы и методы

1.1.2 Схемы экспериментов

1.1.3 Результаты и их обсуждение

1.1.4 Выводы

1.2 Изучение УФ-индуцированной агрегации модельного белка карбоангидразы
1.2.1 Материалы и методы
1.2.2 Результаты и их обсуждение
1.2.3 Выводы
ГЛАВА 2. Исследование УФ-индуцированной агрегации кристаллинов хрусталика глаза при воздействии излучения ХеС1 лазера
2.1 Материалы и методы
2.2 Результаты и их обсуждение
2.2.1 Исследование УФ-индуцированной агрегации рЬ-кристаллина
2.2.2 Исследование УФ-индуцированной агрегации смеси кристаллинов
2.3 Выводы
ГЛАВА 3. Построение модели фотоагрегации водорастворимых белков и сравнение с экспериментом

3.1 Оценки
3.2 Физическая модель фотоагрегации
3.2.1 Режим непрерывного УФ-облучения
3.2.2 Воздействие на раствор белка импульсного УФ-излучения
3.2.3 Выводы
3.3 Исследование постагрегации. Самосогласование модели
3.4 Заключение
ГЛАВА 4. Экспресс-метод исследования УФ-лазерной агрегации водорастворимых белков и некоторые его применения
4.1 Исследование влияния короткоцепочечных пептидов на скорость УФ-индуцированнон агрегации смеси кристаллинов
4.1.1 Материалы и методы
4.1.2 Результаты и их обсуждение
4.2 Обобщение модели на случай слабых интенсивностей
4.3 Подбор новых антикатарактальных добавок
4.4 Повышенная чувствительность рАЗ-кристаллина с измененным строением молекулы (укороченной аминокислотной цепочкой) к фотоагрегации, вызванной УФ-излучением
4.4.1 Материалы и методы
4.4.2 Результаты
4.4.2.1 Кинетика фотоагрегации, вызванной УФ-облучением
4.4.2.2 Исследование физико-химическими методами
4.4.2.3 Влияние концентрации раствора
4.4.3 Выводы
4.5 Заключение
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК РАБОТ ПО ДИССЕРТАЦИИ
ЛИТЕРАТУРА

ВВЕДЕНИЕ
За почти полувековой срок, прошедший с момента создания первого оптического квантового генератора, лазерное излучение получило применение в самых различных областях промышленности, техники, медицины. В настоящее время в связи с развитием лазерных технологий большое внимание уделяется исследованию взаимодействия лазерного излучения с веществом (см. например монографии [1-3]). Одним из важных направлений этих исследований является изучение взаимодействия лазерного излучения с полимерными средами [4-5]. Поглощение материалом лазерного излучения вызывает нагрев, полимерного вещества, что, в свою очередь, может приводить к разрыву полимерных цепей, их сшиванию, выделению газообразных продуктов, и связанным с этим механическим эффектам. При воздействии излучения УФ лазеров важную роль могут играть также фотохимические реакции, которые не связаны с общим нагревом вещества.
Изучение воздействия лазерного излучения на биологические среды важно для применения в медицинских целях [6-9]. Особенностью воздействия на эти среды является то, что мягкие биологические ткани в значительной степени состоят из воды, что приводит к специфической реакции вещества на лазерный нагрев [10-13], а также то, что белки, составляющие основу тканей, являются молекулами со сложной пространственной структурой. Лазерное воздействие может приводить к значительному изменению этой структуры - к денатурации, которая существенно изменяет свойства этих молекул [14, 15].
Тепловая денатурация белков часто сопровождается агрегацией молекул [16-17]. Разворачивание водорастворимых белковых молекул Оunfolding) приводит к "обнажению" гидрофобных остатков, и движущей силой агрегации являются гидрофобные взаимодействия между развернутыми молекулами [18-20]. Важно подчеркнуть различие между процессами ассоциации и агрегации. Ассоциацией (или самосборкой; self-
Измерение мощности рассеянного излучения пробного пучка проводилось методом темного поля [120]. Пробный пучок, проходящий через кварцевую кювету (размеры кюветы: длина вдоль пробного пучка 10 мм, вдоль УФ-пучка 5 мм и высота 10 мм) с необлученным раствором белка (5), фокусировался линзой (8) на непрозрачный экран (9). В процессе УФ-облучения появляющееся рассеянное излучение приводило к увеличению расходимости пробного пучка, поэтому линза (8) фокусировала такой пучок в область, находящуюся за экраном (9). Мощность рассеянного излучения измерялась фотодиодом (10). Одновременно с измерением мощности рассеянного излучения 633 нм в процессе облучения проводились измерения и на-длине волны 308 нм. Измерялась энергия прошедших через кювету, с белком импульсов эксимерного лазера с помощью измерителя, энергии Joulemeter. ED-200 (фирма Gentec Inc., _Сапайа)_с_диаметром апертуры,23 мм (6), который находился на расстоянии 15 см после кюветы. Такая,' схема позволила, измерять непосредственно в процессе УФ облучения изменение пропускания белка на длине волны 308 нм.
После УФ-облучения карбоангидразы различными дозами снимались оптические спектры пропускания на спектрофотометре Specord М40 (фирма Cari Zeiss).
Кроме оптических методов в данной работе использовался метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) [128] с использованием аналитической колонки Superose 12HR 10/30 (Pharmacia Biotech). Хроматография проводилась в буфере: 25 мМ‘ Трис-НС1, 200 мМ NaCl, 3 мМ NaN3 (pH = 7,2) со скоростью протока 0,3 мл/мин. Колонка была прокалибрована молекулярно-массовыми стандартами: голубой декстран 2000, тиреоглобулин, ферритин, каталаза, альдолаза, альбумин, овальбумин, химотрипсиноген, рибонуклеаза А, цитохром С, апротинин, витамин В п (Pharmacia Biotech, Sigma). Перед хроматографией образцы фильтровались через фильтр с минимальной сорбцией (PVDF) Millex®-GV с размерами пор 0,22 мкм.