Применение спектроскопии спиновых и флуоресцентных зондов для изучения параметров микроокружения в растворах и биомембранах

• Автор: Глазачев, Юрий Иванович
• Шифр специальности: 01.04.17
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 95 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

§ 1. Спектроскопия ЭПР спиновых зондов имидазолинового и

имидазолидинового типов.

1.1. Свойства радикалов имидазолинового и имидазолидинового типов: рН-чувствительность спектров ЭПР
1.2. Реакция протонирования нитроксильных радикалов как вид химического (частотного) обмена

1.3. Кинетический изотопный эффект в реакциях протонного обмена

1.4. Форма линии изотропного спектра нитроксильных радикалов, однородное

и неоднородное уширение
1.5. Бирадикалы, чувствительность спектра к параметрам микроокружения у'
1.6. Развитие методов ЭПР для определения параметров среды in vivo
1.7. Определение концентрации тиолов в растворах и in vivo, применение метода ЭПР
§ 2. Изучение биомембран методом флуоресцентного микрофотолиза
2.1. Биологические мембраны, проблемы латеральной организации
2.2. Метод флуоресцентного микрофотолиза: классический вариант и развитие
Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
§ 1. Стабильные нитроксильные радикалы
§ 2. Метод флуоресцентного микрофотолиза •
Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ
§ 1. Изотопно-замещенные радикалы имидазолинового и
имидазолидиного типов
1.1. Влияние изотопного замещения на форму линии
ОГЛАВЛЕНИЕ

1.2. Протонный обмен в растворе у изотопно замещенных радикалов
1.3. Кинетический изотопный эффект реакции протонного обмена
1.4. ПРИЛОЖЕНИЕ: расчет формы линии для химического (частотного) обмена
1.5. Выводы 56 § 2. Бирадикалы имидазолинового и имидазолидинового типа как
спиновые зонды
2.1. Влияние pH, вязкости и температуры растворов на величину спинового обмена и магнитно-резонансных параметров бирадикалов
2.2. Применение нового дисульфидного бирадикала имидазолидинового для определения концентрации тиолов
2.3. Выводы 70 § 3. Применение метода флуоресцентного микрофотолиза для
определения диффузии белков и липидов в биомембранах
3.1. Измерение коэффициентов диффузии липида и цитохрома Ь5 в липидных мультислоях
3.2. Выводы 77 § 4. Применение методов ЭПР и флуоресцентного микрофотолиза для
изучения параметров окислительного повреждения в биологических системах
4.1. Изучение окслительного повреждения тиолов методом ЭПР
4.2. Влияние окислительного повреждение на подвижность мембраны эритроцитов, метод флуоресцентного микрофотолиза
4.3. Выводы
Выводы
Список литературы
ВВЕДЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ
Молекулярные зонды очень широко используются в различных научных исследованиях и имеют большое прикладное значение. С их помощью можно анализировать процессы, происходящие на молекулярном и субмолекулярном уровнях. Одними из самых распространенных являются парамагнитные и люминесцентные зонды, с применением соответствующих методов спектроскопии. Диапазон свойств и, соответственно, методов в каждом классе достаточно широк и многие из них уже стали рутинными. Дальнейший прогресс идет в двух основных направлениях: синтез новых молекулярных зондов и развитие методик.
Данная работа посвящена изучению новых молекулярных зондов: нитроксильных радикалов (HP) имидазолинового и имидазолидинового типов с помощью метода спектроскопии ЭПР и флуоресцентных зондов с помощью метода восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (fluorescence recovery after photobleaching, FRAP), по другому - метод флуоресцентного микрофотолиза. Работа является методической, её цель - это изучение основных спектральных характеристик представленных зондов, чувствительность к параметрам микроокружения. Полученные данные рассматриваются с точки зрения дальнейшего применения изучаемых соединений в научных исследованиях.
Нитроксильные радикалы данных типов являются рН-чувствигельными, благодаря наличию легко протонируемого азога в третьем положении гетероцикла, что проявляется во влиянии на константу сверхтонкого взаимодействия (СТВ) и величину g-фактора [1, 2]. Данное свойство позволяет измерять pH в растворе в районе рК радикалов методом ЭПР, что определило широкое применение этих соединений как pH-зондов в биологических системах и дало толчок к обширному изучению и синтезу новых HP. В настоящее время существуют HP с широким диапазоном рК и обладающие различными химическими свойствами [3].
Особый интерес представляют бирадикалы, у которых имеется спин-спиновое взаимодействие между монорадикальными фрагментами. Это приводит к появлению в спектрах ЭПР дополнительных “бирадикальных” компонент.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

слабого ультразвука в течение 20 минут при 30°С. Чтобы удалить невстроившийся липидный зонд, полученную смесь отмывали раствором альбумина (2 мг/мл) с последующим осаждением и отбиранием супернатанта, процедуру повторяли 4-5 раз. Готовые образцы хранились при 4°С и использовались с течение одних суток. Для нанесения на предметное стекло для эксперимента бралось 20 мкл раствора.
Математическая обработка кинетик в методе FRAP производилась с помощью нелинейного метода наименьших квадратов. Кинетики апроксимировались функцией классической кинетики восстановления флуоресценции (1-15). На одном образце при одних условиях делалось 5-10 измерений, в случае экспериментов с липосомами, и 10-15 измерений - при работе с эритроцитами, с последующим усреднением. Программное обеспечение было написано автором на языке Паскаль на компьютере Электроника-60 и, в дальнейшем, на IBM-совместимом.