Исследование низкотемпературной динамики белков методом выжигания провалов

• Автор: Понкратов, Владимир Владимирович
• Шифр специальности: 01.04.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Троицк
• Количество страниц: 100 с. : ил.

Глава 1. Модели низкотемпературных релаксационных процессов в стеклах, полимерах и белках

Модель двухуровневых систем (ДУС)

Модель диффузионного движения

Основные выводы

Глава 2. Экспериментальная установка и спектроскопические методики исследования низкотемпературных релаксационных процессов в белках: метод выжигания провалов

Метод выжигания провалов

Исследование спектральной диффузии во временной шкале

Термические циклы

Исследование временной и температурной стабильности спектрального провала

Глава 3. Исследование флуктуационных и релаксационных процессов в белках при низких температурах

Объекты исследования и их свойства

Неоднородное уширение в белках
Равновесная и неравновесная спектральная диффузия в белках
Тепловые циклы
Форма провала
Исследование стабильности фотопродукта на основе измерения стабильности спектрального провала
Заключение
Список рисунков
Список таблиц
Список литературы
Благодарности

«Одной из основных задач исследования белка является выявление связи между структурой, энергетическим ландшафтом, динамикой и его биологической функцией».
Г.Фрауенфельдер
В последние десятилетия интерес к биологическим объектам возрос не только в связи с развитием и потребностями медицины и биотехнологии, но и потому, что эти объекты обладают уникальными физическими и химическими свойствами. Физическая структура белков отличается от структуры классических объектов исследования физики конденсированных сред: кристаллов, жидкостей, стекол, и потому представляет специальный интерес для физических исследований.
Белки представляют собой биополимерные цепочки, состоящие из ограниченного набора аминокислот, последовательность которых задает первичную структуру белка. Число аминокислот в белках может насчитывать более сотни, а характерный размер и вес белков может варьировать в широких пределах. Одной из главных особенностей белков является компактная трехмерная структура, приобретаемая в процессе „схлопывания“ биополимерной цепочки. Расположение атомов в такой структуре характеризуется упорядоченностью, которая может быть классифицирована как вторичная, третичная и четвертичная структура [1]. Одним из наглядных примеров вторичной структуры является спиралевидная форма белковой молекулы. Трехмерная атомная структура многих белков хорошо известна. Однако в масштабе меньше 0.2 А структура белка характеризуется беспорядком [2,3]. Упорядоченная структура белков ответственна за их биологическую функциональность, тем не менее, наличие беспорядка также имеет огромное значение и играет
важную роль, к примеру, в процессе сворачивания биополимерной цепочки [4], Именно такая специфичность: наличие порядка и беспорядка в белках выделяет их как отдельные объекты исследования, свойства которых лежат между кристаллическим и аморфным состоянием.
Изучение структуры биологических кристаллов выявило ряд особенностей, отличающих их от «обычных» кристаллов. Так, среднеквадратичное отклонение от равновесного положения <х2>, усредненное по одному и тому же классу атомов для разных аминокислот, сильно отличается [2,3]. С понижением температуры амплитуда колебаний <х2> уменьшается, однако даже при гелиевых температурах <х2> значительно больше величины, соответствующей квантовомеханическим колебаниям решетки. В пионерских работах по рентгеноструктурному анализу белковых кристаллов было высказано предположение, что при низких температурах среднеквадратичное отклонение <х2> определяется неупорядоченностью, вызванной существованием различных конформационных состояний белка [2,3]. Концепция конформационных состояний в белке также подтвердилась в кинетических исследованиях методом фотолиза [5]. Различные конформационные состояния отличаются друг от друга небольшой реорганизацией структуры белка за счет изменения взаимного расположения атомов. В каждом из таких состояний белок способен выполнять биологическую функцию, скорость которой может варьировать. Конформационные состояния в белках образуют иерархическую структуру. Состояния, имеющие значительные структурные отличия, относят к уровню низкого (нулевого) порядка. К примеру, в СО - миоглобине такие состояния связаны с положением связи СО по отношению к плоскости гем - группы белка [6]. Число таких конформационных состояний невелико, конформеры разделены высокими энергетическими барьерами. Уровни высокого порядка характеризуются большим набором конформационных состояний, которые разделены более

релаксационных процессов в сахарной матрице (трехалоза). Молекулы трехалозы обладают тем свойством, что при комнатной температуре в стеклообразном состоянии приводят к значительному ускорению процессов рекомбинации СО [87]. Это может быть связано с уменьшением подвижности белка в твердой матрице, что замедляет диффузию СО из
щ белка в растворитель. При этом важное влияние на скорость рекомбинации оказывает наличие молекул воды в ядре белка [88].
При криогенных температурах растворитель также оказывает влияние на релаксационные процессы в белках. К настоящему времени при криогенных температурах было исследовано влияние молекул трехалозы и эффекта дейтерирования на низкотемпературную динамику белка [27-29]. Было обнаружено, что дейтерирование белка приводит к уменьшению СД, а наличие молекул трехалозы в растворителе приводит к ее возрастанию. В данных работах влияние растворителя на флуктуационные процессы в белках, а также наблюдаемая степенная зависимость СД были проанализированы в рамках модели диффузионного движения [45,90]. В настоящей работе мы продолжили исследование влияния матрицы на низкотемпературную динамику белка. При этом анализ экспериментальных данных по СД был расширен, результаты проанализированы не только в рамках модели диффузионного движения [89,90,91,92], но и в рамках модели ДУС.
• Модель диффузионного движения, так же как и модель ДУС, является
феноменологической моделью. В ней предполагается, что низкотемпературные релаксации в неупорядоченной системе являются результатом кооперативного движения атомов, которое в фазовом пространстве состояний белка может быть описано как диффузионный процесс. В модели свободного блуждания по траектории предсказывается степенная временная зависимость СД в оптических спектрах как следствие предположения о диффузионном движении в пространстве частот и