Исследование дискриминации ионообразования в электроспрее и Maldi методах ионизации для количественного анализа белков

• Автор: Новиков, Александр Валерьевич
• Шифр специальности: 01.04.01
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 87 с. : ил.

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ПО ТЕМЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Исследование белка с помощью масс-спектрометрии

2.2. Основные методы ионообразования термолабильных веществ

2.2.1. Образование ионов при электрораспылении

(Electrospray Ionization, ESI)

2.2.2. Ионизация лазерной десорбции в присутствии матрицы

(Matrix assisted laser Desorbtion / Ionization, MALDI)

2.3 .Масс-анализаторы

2.3.1.Магнитные секторные масс-анализаторы

2.3.2. Времяпролетные масс-анализаторы

2.4. Методики определения количества белка с использованием масс-спектрометрии
3. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Получение аминокислотных стандартов
3.2. Количественный анализ аминокислот
3.2.1. Количественный анализ аминокислот с использованием
ESI-MS
3.2.2. Количественное определение аминокислот с использованием
MALDI-MS
3.3. Определение количества белков
3.3.1. Определение количества белка с помощью ESI-MS
3.3.2. Определение количества белков с помощью MALDI-MS
3.3.3.Использование масс-спектрометрии при изучении функциональных свойств протеиназ
eg 4. Материалы и методы
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время масс-спектрометрия является ключевым инструментом в исследованиях в области химии белка. Особенно это относится к идентификации различных пептидов и белков, аминокислотная последовательность которых может быть взята из различных баз данных, либо предсказана на, основании генома. Однако для понимания физиологических процессов на молекулярном уровне важным является не только идентифицировать отдельные белки, но и количественно оценить их содержание в биологических средах. Это вызвано, прежде всего, тем, что изменение концентраций отдельных белков определяет состояние живых организмов. Для анализа теромолабильных и труднолетучих соединений, к которым и относятся белки, наиболее часто используют масс-спектрометрию с ионизацией электрораспылением (Electrospray Ionization Mass-Spectrometry, ESI-MS) и ионизацией лазерной десорбцией в присутствии матрицы (Matrix-Assisted Laser Desorptioiyionization Mass-Spectrometry, MALDI-MS). Оба этих масс-спектрометрических метода, по причине дискриминации ионообразования и конкуренции за протон между отдельными компонентами смеси веществ, не позволяют определять количественные параметры. Работы в этом направлении с использованием именно масс-спектрометрии интенсивно развиваются, однако все предлагаемые к настоящему времени подходы связанны с необходимостью дополнительных химических модификаций и созданием в каждом отдельном случае соответствующих стандартов. В связи с этим изучение дискриминации в ионообразовании и ее преодоления в мягких ионизационных методах, таких как ESI и MALDI с целью их адаптации к количественному анализу белков, имеет как теоретическую, так и практическую ценность.

Таблица 3.4.
Определение количества аргинина и лизина с использованием в качестве стандартов коммерческих аминокислот (В^Ьуэ, 13К2-Аг§) на
МАЦЛ-Мв.
Опыт Количество стандарта в смеси, пмоль/мкл Количество аминокислоты, пмоль/мкл Погрешность, %
Эксперимент. Заданная
1. Ьуя 10.65 1.45 1.4 3
2. Ьуэ 4.2 2.88 2.9 0
3. Ьуэ 1.3 1.2 ■ 1.2 0
4. Ьув 0.21 0.14 0.14 0
5. Ьуэ 0.084 0.053 0.057 7
6. Ьуэ 0.017 0.013 0.015 13
1. Ащ 10.65 1.45 1.4 3
2. Ащ 4.2 2.88 2.9 0
3. Аг§, 1.3 1.2 1.2 0
4. Arg 0.21 0.14 0.14 0
5. AIg 0.084 0.053 0.057 7
6. Аг% 0.017 0.013 0.015 13
3.3. Определение количества белков.

После окончания апробации метода количественного анализа на аминокислотах, перешли к работе с модельными белками.
Разработанная методика количественного анализа белков основывается на определении концентрации отдельных аминокислот, входящих в состав исследуемого белка, после его кислотного гидролиза путем измерения