Особенности протеома мочи здорового человека при влиянии факторов космического полета

• Автор: Образцова, Ольга Анатольевна
• Шифр специальности: 14.03.08, 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 115 с. : ил.

 СПИСОК СОКРАЩЕНИИ
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Физиологические аспекты мочеобразования
2.2. Моча как объект протсомного исследования
2.3. Изучение белкового состава мочи в условиях космического полета
2.4. Изменения белкового состава мочи в экспериментах по моделированию факторов космического полета
2.4. 1. Изменение белков мочи в условиях длительной изоляции в гермообъекте
2.4. 2. Изменения белков мочи в условиях «сухой» иммерсии
2.5. Методы исследования протеомного профиля мочи человека
2.5. 1. Применение масс-спектрометрии для анализа протеомного профиля мочи
2.5.2. Прямое масс-спектрометрическое профилирование
2.5.3. Технология префракционирования образцов на магнитных частицах перед МЛЬОКТОГ масс-спектромегрией
2.5. 4. Преимущества и недостатки прямого масс-спектрометрического профилирования
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Материалы исследования
3.2. Объекты исследования
3.3. Циклограмма получения образцов мочи и условия эксперимента по моделированию факторов космического полета
3.3.1. Длительные космические полеты
3.3.2. 105-суточная изоляция в гермообъекте
3.3.3 5-суточная «сухая» иммерсия
3.4. Методы исследования
3.4. 1. Получение проб мочи
3.4. 2. Предобработка образцов мочи с использованием магнитных

частиц СНпРгЫ МВ Н1С С8 («Вгикег БаЛошсз»)
3.4.3. Масс-спектрометрические измерения
3.4. 4. Анализ масс-спектров
3.4.5. Контроль качества масс-спектров
3.4. 6. Статистический анализ
3.4. 7. Пробоподготовка образцов мочи к хромато-масс-спектрометрическому анализу
3.4.8. Хромато-масс-спектрометрический анализ
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Прямое протеомное профилирование мочи здоровых добровольцев в эксперименте с 5-суточной «сухой» иммерсией
4.2. Исследование вариабельности протеома мочи здорового человека в эксперименте с контролируемыми условиями жизнедеятельности
4.3. Выявление и анализ белок-белковых взаимодействий на основе изучения протеома мочи здорового человека в эксперименте со 105-суточной изоляцией в гермообъекте
4.4. Протеомный профиль мочи космонавтов после продолжительных космических полетов на МКС
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
6. ВЫВОДЫ
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
CV — коэффициент вариации ESI - электроспрейная ионизация
НССА - а-циано-4-гидраксикоричная кислота (hydrocinnamic acid)
MALDI-TOF MS - время-пролетная масс-спектрометрия с лазерной десорбцией и ионизацией с помощью матрицы (matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry)
MB HIC - магнитные частицы, функционирующие по принципу обращенно-фазового взаимодействия (magnetic beads based hydrophobic interaction chromatography)
MS/MS - тандемная масс-спек грометрия m/z - отношение массы к заряду, Дальтон
SELDI - усиленная поверхностью лазерная десорбция-ионизация
SELDI-TOF MS - время-пролегная масс-спектрометрия с ионизацией SELDI (surface
enhanced laser desorptiom-ionization time of flight mass spectrometry)
МКС - Международная Космическая Станция
AQP - аквапорин
GBM - базальная мембрана
PTMs - посттрансляционные модификации белков
TJ - межклеточные контакты
IDE - одномерный электрофорез
2DE - двумерный электрофорез
LC - жидкостная хроматография
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
КП - космический полет
ПК - проксимальный каналец нефрона
СИ - сухая иммерсия
ПВ - период восстановления
Ф - фоновый период
ББВ/PPI - белок-белковые взаимодействия

3.4. 7. Пробоиодготовка образцов мочи к хромато-масс-спектрометрическому анализу
Осаждение белка мочи проводили согласно протоколу обработки мочи для скрининга, утвержденному на рабочем совещании во время конференции HUPO-2007, Сеул, Корея (состав участников: Е.Н. Николаев, К. Масселон, С.А.Мошковский,
В.Г.Згода, В.Брюн).
Работа проходила в 4 этапа:
1) Восстановление белка - образец, высушенный в вакуумном концентраторе, растворяли в восстанавливающем буфере (1) до конечной концентрации белка, приблизительно 10 мг/мл (+150 мкл), добавляли DL-Dithiothreitol до конечной концентрации ОДМ (+7,5 мкл 2 М раствора DL-D). Полученную смесь продували под струей азота 25 - 30 секунд и инкубировали в течение 3 часов при 37° - 42°С.
Восстановление было необходимо проводить для того, чтобы разорвать дисульфидные мостики в молекуле белка, с тем, чтобы после трипсинолиза пептиды были в виде отдельных линейных форм, а не в виде двух и более пептидов, связанных друг с другом дисульфидными связями. Таким образом, количество свободных пептидов доступных для анализа увеличивалось. ДТТ - один из восстановителей, способный разрушать дисульфидные связи.
2) Алкилирование белка - реакционную смесь охлаждали на льду, добавляли (в количестве 1/10 от объёма биопробы) 0,55 М раствор йодацетата (+15 мкл), приготовленного в буфере для алкилирования (2). Полученную смесь продували под струей азота 25 - 30 секунд и инкубировали 45 минут при комнатной температуре в недоступном для света месте.
Алкилирование необходимо для того, чтобы модифицировать восстановленные пептиды с тем, чтобы они не могли в дальнейшем реагировать с восстановлением связи.
3) Осаждение белков - в пробу добавляли 0,1 % раствор трифторуксусной кислоты в ацетоне (4 части раствора к 1 части пробы) и оставляли на ночь при -20°С. Затем центрифугировали 10 минут при 4°С, 14 000 g. Осадок ресуспендировали в ацетоне и центрифугировали при 10 минут 4°С, 14 000 g. Осадок ресуспендировали в 96% этаноле, затем центрифугировали при 10 минут 4°С, 14 000 g. Полученный осадок высушивали при 45 - 60°С.
Полученный белок помещали для длительного хранения в сухом виде при температуре ниже -20°С.