Клинико-генетический анализ бокового амиотрофического склероза в российской популяции

• Автор: Лысогорская, Елена Владимировна
• Шифр специальности: 14.01.11
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 106 с. : 14 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
Г ЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Основные теории патогенеза БАС
1.2. Роль гена SOD1 и описанные генетические локусы при БАС
1.3. Значение генов-регуляторов метаболизма РНК при БАС
1.4. Анализ генетических ассоциаций в спорадических случаях БАС 23 ГЛАВА 2. Общая характеристика материалов и методов исследования
2.1. Обследованные пациенты и семьи
2.2. Молекулярно-генетическое исследование
2.3. Молекулярное моделирование
2.4. Статистическая обработка данных
ГЛАВА 3. Результаты
3.1. Анализ клинических фенотипов БАС в обследованных
спорадических и семейных случаях заболевания
3.2. Результаты молекулярно-генетического обследования
3.2.1. Мутационный скрининг гена SOD1
3.2.2. Анализ in silico мутаций гена SOD
3.2.3. Исследование мутаций в гене TARDBP
3.2.4. Исследование мутаций в гене ANG
3.2.5. Исследование гена ATXN2
3.2.6. Анализ ассоциаций БАС с генами VEGF и АРОЕ
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ПРИЛОЖЕНИЯ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность исследования.
Боковой амиотрофический склероз (БАС) является неуклонно прогрессирующим нейродегенеративным заболеванием неустановленной этиологии. Данное заболевание связанно с поражением двигательных нейронов коры головного мозга, мозгового ствола и передних рогов спинного мозга и характеризуется развитием параличей и гибелью пациентов от нарушения дыхательных и бульбарных функций в течение 2-5 лет от момента дебюта симптомов болезни (Завалишин, 2009). Неуклонное прогрессирование заболевания, короткая продолжительность жизни от момента дебюта симптоматики, сложность диагностики БАС и рост заболеваемости в молодом возрасте (Васильев, 2008; Скворцова с соавт. 2009) обуславливают высокое внимание исследователей к вопросам этиологии и патогенеза данного заболевания. Выявление причин избирательной гибели двигательных нейронов при БАС является одной из приоритетных задач, стоящих перед исследователями. Ее решение позволит разработать новые современные патогенетические методы лечения данного заболевания.
К настоящему времени отсутствует однозначная концепция, объясняющая природу БАС. Однако, согласно современным представлением, данное заболевание можно отнести к группе мультифакторных болезней (Загоровская с соавт. 2003; Лимборская с соавт. 2005). Общая модель причин возникновения таких заболеваний включает взаимодействие генетических (гены предрасположенности и генетический фон), эпигенетических, средовых (семейных и популяционных) и стохастических (случайных) факторов. Среди факторов риска развития БАС к настоящему времени доказанными факторами являются мужской пол и возраст старше 50 лет (Завалишин, 2009). Кроме того, исследовалось действие таких внешнесредовых факторов, как контакт с пестицидами, тяжелыми и редкоземельными металлами, растворителями и пластмассами, электротравма, механическая травма и других (Brown et al. 2005; Скворцова с соавт. 2009).
В подавляющем большинстве случаев БАС является спорадическим заболеванием, и лишь 5-10% пациентов имеют семейный анамнез БАС (Иллариошкин, 2007). При этом развитие заболевания связывают с мутациями в одном из восемнадцати описанных к настоящему времени генетических локусов. Однако даже в случае спорадической формы заболевания велика роль совокупного или модифицирующего действия множества генов на риск развития заболевания, его клинические особенности и фенотипические проявления. В связи с этим генетические исследования БАС широко проводятся во всем мире и позволяют уточнить патогенетические механизмы развития заболевания и определить круг потенциальных объектов для разработки клеточной и генной терапии БАС (Mackenzie et al. 2010; Miller et al. 2007; Brown et al. 2012).
В российской популяции изучение генетических факторов при БАС было начато около 10 лет назад (Брусов с соавт. 2003; Скворцова с соавт. 2003): исследователями был оценен вклад генов SOD1 (Кондратьева с соавт. 2000), NEFH (Skvortsova et al., 2004) и генов системы детоксикации (Скворцова с соавт. 2006) в развитие БАС на небольшой выборке пациентов. В настоящее время в связи с открытием большого числа новых генов и совершенствованием технологий мутационного скрининга исследования молекулярных основ БАС вышли на качественно новый уровень, чему и посвящена данная диссертационная работа.
Цель исследования.
Клинический и молекулярно-генетический анализ семейных и спорадических случаев БАС в российской популяции, с выявлением мутаций и предрасполагающих полиморфизмов в кандидатных генах, установлением соотношения конкретных генетических вариантов БАС в России и проведением клинико-генетических сопоставлений.

праймеров (температуру см. в приложении 3) - 10 с и элонгация цепи при 72°С - 25 с; заключительная элонгация при 72°С - 5 мин на программируемом термоциклере «Терцик» («ДНК-Технология»),
Полученный ПЦР-продукт подвергали ферментативной очистке в 5 мкл реакционной смеси, содержащей: 2,5 мкл образца, 0.5 ед. креветочной щелочной фосфатазы (SAP, Promega) и 5 ед. экзонуклеазы 1 (exol, Fermentas); при температуре 37°С - 30 мин с последующей инактивацией ферментов при 37°С - 15 мин.
Сиквенсовую реакцию проводили на программируемом термоциклере Veriti («Applied Biosystems») с использованием набора: BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit («Applied Biosystems»), по протоколу: начальная денатурация при 96°С - 1 мин и далее 25 циклов с температурно-временным режимом: 96°С - 10 с; 50°С - 5 с; 60°С - 4 мин.
Сиквенсовый продукт чистили изопропиловым спиртом:
- 100 мкл 75% изопропилового спирта добавляли к 10 мкл полученной реакционной среды и 15 мин. выдерживали при комнатной температуре и постоянном перемешивании;
- 20 мин. центрифугировали со скоростью 13 000 об/мин при 4°С;
- к осадку добавляли 60 мкл 75% изопропилового спирта и повторно центрифугировали в течение 2 мин со скоростью 13 000 оборотов при 4°С;
- осадок высушивали 3 мин при 65°С.
Анализ нуклеотидных последовательностей образцов проводили на капиллярном генетическом анализаторе ABI Prism 3130 («Applied Biosystems») с помощью программного обеспечения Data Collection Software версии v3.0, Sequencing Analysis Software версии v5.2 и SeqScape Software версии v2.5.
ПЦР в режиме реального времени.
Для уточнения патогенетической значимости найденных интронных мутаций, расположенных в функционально важных регионах генов TARDBP и