Физиолого-биохимические характеристики хрусталика крыс в постнатальном онтогенезе

• Автор: Князев, Дмитрий Игоревич
• Шифр специальности: 03.03.01
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Нижний Новгород
• Количество страниц: 145 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Принятые сокращения
Введение
Г лава 1. Обзор литературы
1.1 Развитие хрусталика в онтогенезе, краткий обзор
морфологии и анатомии хрусталика
1.2. Физиологические и биохимические особенности хрусталика
1.2.1. Кристаллины как основные структурные белки хрусталика
1.2.2. Межклеточный транспорт
1.2.3. Цитоскелет
1.2.4. Мембраны
1.2.5. Редокс-гомеостаз хрусталика
1.3. Процессы модификации липидов и белков хрусталика
в ходе постнатального развития
1.3.1. Окисление и деградация липидов
1.3.2. Модификации белков хрусталика в ходе постнатального развития
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Экспериментальные группы животных, подготовка проб, аппаратная база
2.2. Реактивы
2.3. Основные методы исследования
2.3.1. Оценка концентрации общих липидов и общих белков
2.3.2. Экстракция липидов, спектральные измерения липидной фракции хрусталиков
2.3.2.1 Экстракция липидов
2.3.2.2. Определение молекулярных продуктов свободнорадикального окисления липидов и уровня ненасыщенное
2.3.2.3. Анализ уровня липофильных антиоксидантов

2.3.3. Исследование концентрации ТБК-активных комплексов
2.3.4. Изучение структурных параметров протеома и белковых модификаций
2.3.4.1. Определение тиоловых (БН-) групп
2.3.4.2. Оценка карбонильных производных
2.3.4.3. Измерение флуоресценции триптофанила, КИНГ, битирозиновых сшивок
2.3.4.4. Анализ уровня поверхностной гидрофобности
2.3.5. Исследование ферментативной активности каталазы
и супероксиддисмутазы
2.3.6. Хроматографический анализ липидов
2.4. Анализ аминокислотных последовательностей
кристаллинов крыс
2.5. Обработка данных
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение
3.1. Оценка основных физиологических и биохимических параметров хрусталика крыс в постнатальном развитии
3.1.1 Уровень белка в гомогенате и водорастворимой
фракции хрусталиков
3.1.2. Уровень общих липидов
3.2. Возрастная динамика накопления продуктов свободнорадикального окисления липидов в хрусталиках крыс
3.2.1. Концентрации первичных продуктов
3.2.2. Уровни вторичных и конечных продуктов
3.3. Динамика уровня двойных связей и накопления липофильных антиоксидантов
3.4. Возрастная динамика активности каталазы и супероксиддисмутазы
3.5. Модификации и структурные характеристики белков хрусталика
3.5.1. Сульфгидрильные группы в гомогенате и водорастворимой

фракции
3.5.2. Динамика концентраций карбонильных производных
3.5.3. Конечные продукты неферментативного гликозилирования
3.5.4. Возрастной профиль изменения флуоресценции триптофана
и уровня поверхностной гидрофобности
3.5.5. Динамика уровня битирозина в водорастворимой
фракции хрусталиков крыс
3.6. Особенности и динамика изменений липидного состава
хрусталиков крыс в ходе постнатального онтогенеза
3.6.1. Соотношения фосфолипидов и нейтральных липидов
3.6.2. Динамика фосфолипидного состава хрусталиков
3.6.3. Состав нейтральных липидов в хрусталике крыс
Заключение
Выводы
Список литературы

разделения фаз, верхнюю водную фазу удаляли. Нижнюю органическую фазу промывали 1 мл смеси 0,75%-КС1 + метанол + хлороформ в соотношении 48:47:3. После разделения фаз верхнюю водную фазу удаляли. В 3 пробирки (для оценки уровня мелекулярных продуктов, оснований Шиффа, липофильных витаминов) помещали по 1 мл очищенного экстракта липидов и упаривали в токе азота на водяной бане.
2.3.2.2 Определение молекулярных продуктов свободно-радикального окисления липидов и уровня ненасыщенности.
Содержание диеновых конъюгатов (ДК), сопряжённых кетодиенов (СКД) и двойных связей (ДС) (уровня ненасыщенности) определяли спектрофотометрически (Shenstone, 1971). После упаривания 1 мл экстракта в пробирки добавляли по 4 мл смеси метанол-гексан в соотношении 5:1. Инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 1,5 часов, интенсивно встряхивая пробы каждые 15 мин. После инкубации опытные пробы фотометрировали при длинах волн 219 нм (ДС), 233 нм (ДК) и 275 нм (СКД) против смеси метанол-гексан. При расчёте концентрации ДК в липидной фракции использовали значение коэффициента молярной экстинкции равное 2,35* 105 л-моль"'-см‘' (Wheatley, 2000) и выражали в нмоль/мг липидов. Уровень СКД и ДС выражали в единицах оптической плотности на 1 мг липидов.
Содержание оснований Шиффа (ОШ) определяли спектрофлуориметрически (Fletcher et al., 1973). После упаривания 1 мл экстракта в пробирки добавляли по 3 мл смеси метанол-хлороформ в соотношении 2:1. Инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 1,5 часов, интенсивно встряхивая пробы каждые 15 мин. После инкубации проводили измерения интенсивности флуоресценции: Хвю6 = 370 нм, А,исп = 450 нм. Содержание ОШ выражали в единицах оптической плотности на 1 мг липидов.