Реакция усиленной хемилюминесценции, катализируемая анионными пероксидазами растений, и ее применение в иммуноферментном анализе

• Автор: Вдовенко, Марина Михайловна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 147 с. : ил.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
Г1С - пероксидаза из бобов сои;
ПХ - пероксидаза из корней хрена;
ПБ - пероксидаза из клубней батата;
ПП - пероксидаза из листьев пальмы;
ПТ - пероксидаза из листьев табака;
ЩФ - щелочная фосфатаза, выделенная из тонкого кишечника телят;
АБТС - диаммониевая соль 2,2’-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты); ТМБ - 3,35,5’-тетраметилбензндин дигидрохлорид;
ИФА - иммуноферментный анализ;
тИФА - твердофазный иммуноферментный анализ;
ПО - предел обнаружения;
БСА - бычий сывороточный альбумин;
ДМФА - диметилформамид;
ДМСО - диметилсульфоксид;
ФТПС - натриевая соль 3-(10’-фенотиазшшл)-пропан-1-сульфоната;
ФПК- 3-(10’-фенотиазинил)-пропионовая кислота;
ХФПК- 3-(10’-(2’-хлор)-фенотиазинил)-пропионовая кислота;
4-ИФ - 4-йодофенол;
ДМАП - 4-диметиламинопиридин;
МП - 4-морфолинопиридин;
ПирП - 4-пирролидинопиридин;
ТГ - тиреоглобулин;
анти-ТГ-АТ - поликлональные антител против тиреоглобулшга;
анти-ТГ-АТ-ПС - конъюгат поликлональных антител против тиреоглобулина с
пероксидазой сои;
анти-ТГ-АТ-ПХ - конъюгат поликлональных антител против тиреоглобулина с
пероксидазой хрена; _ _ _ __
ОТ А - охратоксин А;
анти-ОТА-мАТ - моноклональные антитела против охратоксина А;
ОТА-ПС - конъюгат охратоксина А с пероксидазой сои;
ОТА-ПХ - конъюгат охратоксина А с пероксидазой хрена;
2.4-Д - 2,4-дихлорфенокспуксусная кислота;
анти-2,4-Д-мАТ - моноклональные антитела против 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты;
2.4-Д-ПС - конъюгат 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты с пероксидазой сои;

ФБС - фосфатный буферный раствор с 0.15 М ЫаС1;
ФБСТ - фосфатный буферный раствор с 0.15 М КаС1 и 0.05% твин-20;
ХЛ - хемилюминесценция;
ХЛС - хемилюминесцентный сигнал;
РУХ - реакция усиленной хемилюминесценции;
ЭПР - электронный парамагнитный резонанс;
ХЛ-ИФА - иммуноферментный анализ с хемилюминесцентной детекцией;
КОЛ-ИФА - иммуноферментный анализ с колориметрической детекцией
ПС/ФТПС/МП - детектирущая система на основе пероксидазы сои, натриевой соли 3-(10’-
фенотиазинил)-пропан-1-сульфоната и 4-морфолинопиридина;
ПХ/4-ИФ- детектирущая система на основе пероксидазы хрена и 4-йодофенола;
- иммуноглобулин класса в;
ПДК - предельная допустимая концентрация.

ОГЛАВЛЕНИЕ
I. ВВЕДЕНИЕ
П. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Иммуноферментный метод анализа
2.1 Л. Классификация методов ИФА
2.1.2. Аналитические характеристики иммуноанализа
2.1.3. Ферменты, используемые в ИФА в качестве меток
2.2 Пероксидазы
2.2.1. Классификация и общая характеристика иероксидаз
2.2.2. Структура иероксидаз
2.2.3. Реакционный цикл пероксидаз
2.2.4. Субстратная специфичность пероксидаз
2.2.5. Методы регистрации ферментативной активности
2.2.5.1. Реакция усиленной хемилюминесценции
2.2.5.1.1. Механизм реакции усиленной хемилюминесценции
2.2.5.1.2. Инактивация пероксидазы пероксидом водорода в ходе реакции хемилюминесцентного окисления люминола
2.2.5.1.3. Анионные пероксидазы в реакции усиленной
хемилюминесценции
Ш. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1. Материалы исследований
3.2. Методы исследований
3.2.1. Колориметрическое определение активности пероксидазы
3.2.2. Выделение пероксидазы батата
3.2.3. Соокисление люминола пероксидом водорода в присутствии усилителей, катализируемое пероксидазой, с хемилюмннесцентной детекцией
3.2.4. Соокисление люминола, ФТПС и МП пероксидом водорода, катализируемое ПС, с хемилюминесцентной детекцией
3.2.5. Изучение окисления производных фенотиазина
3.2.6. Синтез коньюгатов пероксидаз сои и хрена с антителами кролика против тиреоглобулина человека
3.2.7. Синтез конъюгата охратоксина А с пероксидазой сои
3.2.8. Синтез коньюгата пероксидазы сои с 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты
3.2.9. Пробоподготовка бобов сои для проведения ИФА для определения охратоксина А

вирусных и бактериальных инфекций, стероидов и других биологически активных соединений. Применение ТМБ по сравнению с другими субстратами обладает рядом преимуществ. Так, данный продукт обладает наиболее высокой чувствительностью для хромогенных видов анализа пероксидазы, что связано высоким коэффициентом экстинкции продукта реакции его окисления. Более того, ТМБ, в отличие от других субстратов пероксидаз, не является канцерогенным соединением.
С другой стороны, субстраты, образующие при окислении нерастворимый окрашенный осадок, такие как 4-хлорнафгол и 3,3'-диаминобензидин, более пригодны для иммуноанализа с использованием мембран.
Сущность флуориметрических методов заключается в измерении интенсивности флуоресценции молекулы вещества при переходе из возбужденного состояния в основное.
Флуориметрическая детекция активности пероксидазы с использованием п-гидроксифенилпропноновой кислоты обладает рядом преимуществ в сравнении с колориметрической. Данный способ является более высокочувствительным, нежели колориметрия. Кроме того, сигнал фона при флуоресцентной детекции пероксидазы стабилен при комнатной температуре, в то время как фоновой сигнал при использовании колориметрического субстрата повышается во время проведения анализа.
Однако наиболее перспективным способом детекции пероксидазной активности безусловно является хемилюминссценция, процесс излучения фотонов при переходе электронно-возбужденных продуктов химических реакций в исходное энергетическое состояние. В первую очередь это объясняется экстремально высокой чувствительностью метода, которая в свою очередь обусловлена очень низким фоновым сигналом. Более того, высокоэффективные и недорогие люминометры коммерчески доступны. Среди других преимущеста хемилюминесценции можно отметить, что сигнал имеет широкий линейный диапазон. В связи с тем, что это эмиссионный процесс, величина сигнала, как правило, имеет линейную зависимость от концентрации, и верхний предел линейного диапазона определяется избытком реагентов относительно аналита. Линейный диапазон рабочих концентраций может включать до шести порядков значений величины сигнала. Реагенты и коньюгаты для хемилюминесценции обладают высокой стабильностью. Вплоть до сегодняшнего