Роль мембранных транспортных белков в регуляции продукции цефалоспорина C у Acremonium chrysogenum

• Автор: Думина, Мария Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 139 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Цефалоспорин С: открытие, химическая структура, механизм действия антибиотика, продуцируемого Acremonium chrysogenum
1.2 Краткая характеристика Acremonium chrysogenum — продуцента цефалоспорина С.
1.3 Биосинтез цефалоспорина С
1.3.1 Кластеры генов биосинтеза цефалоспорина С
1.3.2 «Ранние» стадии биосинтеза цефалоспорина С
1.3.3 «Поздние» стадии биосинтеза цефалоспорина С
1.4 Роль мембранных белков в биосинтезе
ß-лактамов
1.4.1 Компартментализация реакций биосинтеза ß-лактамов
1.4.2 Роль мембранного транспортера CefP в биосинтезе цефалоспорина С у A. chrysogenum
1.4.3 Роль мембранного транспортера CefM в биосинтезе цефалоспорина С у A. chrysogenum
1.4.4 Роль мембранного транспортера CefT в биосинтезе цефалоспорина С у A. chrysogenum
1.5 Молекулярные основы функционирования белков мультилекарственной устойчивости CefT, CefM, CefP
1.5.1 MFS MDR транспортеры
1.5.2 Создание градиента Н+ ТҐ-АТФазой РМА
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Компьютерное моделирование
2.2 Штаммы и плазмиды
2.2.1 Штаммы, используемые в работе
2.2.2 Плазмиды
2.3 Микробиологические среды и условия культивирования штаммов
2.4 Генно-инженерные методики
2.4.1 Общие молекулярно-генетические методы
2.4.2 Выделение геномной ДНК
2.4.3 Проведение ПЦР
2.5 Конструирование плазмид
2.5.1 Создание кассет экспрессии CefT-TagCFP
2.5.2 Создание кассет экспрессии PMAl-TagYFP

2.6 Получение рекомбинантных штаммов
2.6.1 Трансформация нативных клеток S. cerevisicie плазмидной ДНК
2.6.2 Приготовление и прямая трансформация компетентных клеток A. tumefaciens .
2.6.3 Трансформация A. chrysogenum
2.7 Анализ рекомбинантных штаммов S. cerevisiae J2efT-TngCFP, S. cerevisiae^PMAl-TagYFP
2.7.1 Флуоресцентная микроскопия S. cerev/.s7ae_Cef['-TagCFP, S. cerevisiae_PMA1-TagYFP
2.7.2 Исследование функциональной активности S. cerevisiaeCefT-TagYFP методом диффузии дисков в агар
2.7.3 Исследование функциональной активности S. cerevisiae_CefT-TagYFP методом спот-анализа
2.8 Анализ рекомбинантных штаммов A. chrysogenum_CefT-TagCFP, A. chrysogenum_PMAl-TagYFP
2.8.1 Молекулярный анализ клонов
2.8.2 ВЭЖХ-анализ
2.8.3 Определение содержания внутриклеточного АТФ
2.9 Молекулярное кариотипирование A. chrysogenum
2.10 Анализ экпрессии генов
2.10.1 Получение препаратов тотальной, матричной РНК
2.10.2 ПЦР-анализ в реальном времени
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Сравнительный молекулярно-генетический анализ штаммов A. chrysogenum -штамма дикого типа АТСС 11550 и высокопродуктивного ВКМ F-4081D
3.1.1 Хромосомный полиморфизм штаммов A. chrysogenum АТСС 11550, ВКМ F-4081D
3.1.2 Хромосомная локализация генов биосинтеза цефалоспорина С
3.1.3 Анализ экспрессии генов биосинтеза и транспорта цефалоспорина С в штаммах A. chrysogenum АТСС 11550, ВКМ F-4081D
3.2 Создание систем экспрессии мембранных транспортеров CefT-TagCFP, PMAl-TagYFP для модельного объекта S. cerevisiae
3.3 Исследование субклеточной локализации PMAl-TagYFP, CefT-TagCFP в модельном объекте S. cerevisiae
3.4 Разработка системы функционального анализа белка-транспортера цефалоспорина С CefT-TagCFP в S. cerevisiae
3.5 Создание систем экспрессии мембранных транспортеров CefT-TagCFP, PMAl-TagYFP для A. chrysogenum

3.6 Получение рекомбинантных штаммов A. chrysogenum ВКМ F-4081D_CefT-TagCFP,
A. chrysogenum ВКМ F-4081D_PMAl-TagYFP
3.7 Молекулярный анализ рекомбинантных клонов A. chrysogenum ВКМ
F-4081D_CefT-TagCFP, A. chrysogenum ВКМ F-4081D_PMAl-TagYFP
3.8 Метаболическая инженерия A. chrysogenum-, роль мембранного транспортера PMAl-TagYFP в регуляции продукции цефалоспорина С
3.9 Метаболическая инженерия A. chrysogenum: роль мембранного транспортера CefT-TagCFP в регуляции продукции цефалоспорина С
ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

бензилпенициллина, 100 % увеличению продукции IPN по отношению к контрольному штамму;
- P. chrysogenum преб pyrG- (штамм, полученный из Wisconsin 54-1255, с инактивацией гена penDE, т.е. не обладающий IPN-ацетилтрансферазной активностью и не способный к синтезу бензилпенициллина). В клонах, экспрессирующих CefT наблюдалось 100 % увеличение уровня биосинтеза IPN;
- P. chrysogenum ТА98 (продуцент дезацетилцефалоспорина, экспрессирующий cefDl, cefD2, cefEF, cefG гены A. chrysogenum): cejT трансформанты характеризовались повышением уровня продукции DAC, IPN, PenN. Несмотря на внутриклеточное образование, в культуральной жидкости не было обнаружено значительного содержания конечного продукта цефС.
Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что CefT не транспортирует гидрофобные пенициллины (бензилпенициллин), субстратами белка являются гидрофильные (3-лактамы, содержащие а-аминоадипат в боковой цепи (IPN, PenN, DAC).
Различие в секреции DAC и цефС экспрессируемым в P. chrysogenum CefT достаточно сложно объяснить с точки зрения субстратной специфичности, поскольку оба соединения имеют цефемовое кольцо и боковую группировку а-аминоадипата [86].
Отсутствие цефС в культуральной жидкости P. chrysogenum было объяснено нарушением активности DAC-ацетилтрансферазы; деградацией цефС в культуральной жидкости под действием ацетилгидролаз, что известно для некоторых грибов, включая штаммы дикого типа A. chrysogenum [87]; отсутствием белка-транспортера соединения в P. chrysogenum.
Эксперименты с экспрессией cejT в промышленном штамме A. chrysogenum с уровнем биосинтеза цефС, превышающим 1 мг/мл, показали его незначительный либо слабый отрицательный эффект на выход конечного продукта [88].
В работе по открытию и изучению гена-регулятора cefR в составе «раннего» кластера делается вывод о его отрицательной регуляции транскрипции cejT, что