Разработка и оценка информативности нового способа детекции Ascaris lumbricoides при паразитарных заболеваниях у детей

• Автор: Фархутдинова, Алсу Мансафовна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 113 с. : ил.

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
Абс. - абсолютный показатель
ГБУЗ РДКБ - Республиканская детская клиническая больница
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ДЭ - диагностическая эффективность
ЖКТ - желудочно-кишечный тракт
РНК - рибонуклеиновая кислота
рРНК - рибосомальная рибонуклеиновая кислота
ПЦ «+» - прогностическая ценность положительного результата
ПЦ «-» - прогностическая ценность отрицательного результата
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ЛПУ - лечебно-прафилактическое учреждение
ИО - истинно-отрицательный результат
ИП - истинно-положительный результат
ИФА - иммуноферментный анализ
ЛО - ложноотрицательный результат
ЛП - ложноположительный результат
РБ - Республика Башкортостан

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
Г ЛАВА 1. Методология диагностики аскаридоза (обзор литературы).
1.1. Современные представления об эпидемиологии, патогенезе и клинике аскаридоза
1.2. Характеристика существующих методов диагностики аскаридоза
1.3. Перспективные методы диагностики аскаридоза. Метод молекулярной диагностики
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования
2.1. Методология конструирования диагностической системы
2.2. Характеристика методов, использованных для специфической детекции Ascaris lumbricoides
2.3. Методы статистической обработки полученных данных
ГЛАВА 3. Разработка тест-системы для ПЦР детекции Ascaris lumbricoides.
ГЛАВА 4. Обоснование выбора оптимальной возрастной группы обследуемых для сравнительной оценки информативности разработанной тест-системы
ГЛАВА 5. Сравнительная оценка информативности лабораторных методов исследований, применяемых для обнаружения Ascaris lumbricoides
5.1. Информативность при исследовании клинического материала
5.2. Экспериментальные исследования с образцами почвы и воды ... 64 ГЛАВА 6. Клинические особенности подтвержденного методом ПЦР
аскаридоза у детей
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Одной из основных составляющих состояния здоровья детского населения и взрослых являются протозоонозы и гельминто-зы, на долю которых приходится 99% всех паразитарных заболеваний [59]. По данным Комитета экспертов ВОЗ (2012), аскаридозом в мире ежегодно инфицируется свыше 1 млрд. человек, большинство из которых составляют дети дошкольного и школьного возраста. В Российской Федерации в 2004 году было зарегистрировано 66548 [85] человек. Особое значение при этом приобретают связанные с заболеванием осложнения (задержка физического развития, эпи-лептиформные состояния, токсико-аллергические реакции, а в тяжелых случаях - непроходимость кишечника и даже смерть от асфиксии) у детей.
Несмотря на продолжительный период внимания исследователей к указанной проблеме, реальных успехов в области лечения достичь не удалось. В этой связи наиболее эффективным способом борьбы с данной инвазией во всем мире считают раннюю диагностику заболевания. Однако общепризнанным фактом остается низкая чувствительность и специфичность применяемых в настоящее время методов (методов Като и Миура, методы обогащения (по Фюллеборну, Калантарян или Красильникову), информативных при овоскопии предварительно обогащенных проб больных с низкой интенсивностью инвазии или при диагностике поздних (хронических) стадий заболевания. Причем, даже у больных аскаридозом яйца гельминта не обнаруживаются при паразитировании особей одного пола (3-5%), неполовозрелых самок и старых самок, а также в ряде других случаев.
Ещё большей проблемой является диагностика аскаридоза в период ранней миграционной фазы заболевания, когда это наиболее востребовано клиницистами, поскольку позволяет начать специфическую терапию до появления осложнений заболевания. Для этого предложены рентгенологическая иденти-

(«EPPENDORF», Германия). Пробирки с биоматериалом хранились при температуре минус 20°С.
Для лабораторной диагностики аскаридоза использовали метод толстого мазка фекалий по Като. С этой целью готовили смесь Като, которую хранили при комнатной температуре в бутыли с притертой пробкой. Готовили путем смешивания 500 мл 6%-го раствора фенола с 50 мл глицерина и 6 мл 3%-го водного раствора малахитовой зелени. Кусочки гидрофильного целлофана размером 2x4 замачивали в смеси Като на 24 часа. На предметное стекло наносили комочки фекалий, придавливали резиновой пробкой для получения равномерной толщины мазка. Препарат оставляли для просветления на 1 час при комнатной температуре. Просветленный мазок микроскопировали через целлофановую пленку, в толстом мазке обнаруживали яйца аскарид. Исследование проб фекалий в мазках любого типа на ранних стадиях заболевания не всегда достаточно эффективно из-за низкой численности яиц в исследуемом материале, непостоянства их выделения из кишечника.
Для более тщательного исследования материала дополнительно использовали флотационный метод по Фюллеборну. Применяли флотационную жидкость насыщенного раствора поваренной соли (0,4 кг NaCl на 1 л воды, удельный вес 1,38). Из 2,5-5 г фекалий готовим суспензию в баночке с насыщенным растром натрия хлорида (в соотношении 1:20). С флотационной поверхности готовим отпечатки. Всплывшие яйца концентрировались на предметном стекле. Через 45 мин предметное стекло снимали, быстро переворачивали на оставшуюся на нем пленку, наносили каплю глицерина и исследовали под микроскопом при увеличении 7x40.
Для ранней диагностики аскаридоза применяли созданную нами тест-систему методом высокочувствительного молекулярно-биологического метода полимеразой цепной реакции (ПЦР) (Mullis K., 1983). Для выделения ДНК аскариды использовали метод Грэхэма (Graham, 1978 с некоторыми модификациями). Для этого фрагмент червя растирали в ступке жидким азотом. Затем