Изучение генетического разнообразия вируса мозаики турнепса и создание удвоенных гаплоидных линий Brassica - источников устойчивости к нему

• Автор: Зубарева, Ирина Александровна
• Шифр специальности: 03.01.06, 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 144 с. : ил.

Оглавление
ВВЕДЕНИЕ
I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Вирус мозаики турнепса (TuMV)
1.1.1 Систематика, происхождение и эволюция
1.1.2 Морфология частиц и организация генома
1.1.3 Генетическое разнообразие TuMV
1.1.4 Симптомы, пути распространения и вредоносность
1.2 Растения-хозяева (семейство Brassicaceae)
1.2.1 Систематика, морфобиологические, генетические и физиологические особенности
1.2.2 Устойчивость к TuMV
1.2.3 Устойчивость растений к TuMV, определяемая локусами eIF(iso)4E и eIF4E
1.2.4 Получение гаплоидных растений рода Brassica с использованием культуры микроспор
1.2.5 Заключение
II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Растения и изоляты вируса
2.2 Молекулярно-генетический анализ изолятов
2.2.1 Выделение суммарной РНК из растительного материала
2.2.2 Проведение реакции обратной транскрипции
2.2.3 Проведение полимеразной цепной реакции
2.2.4 Электрофоретический анализ продуктов ПЦР
2.2.5 Выделение ДНК из агарозного геля
2.2.6 Секвенирование ПЦР-фрагментов и биоинформационный анализ нуклеотидных последовательностей
2.3 Определение вирулентности выделенных изолятов TuMV и поиск растений-источников устойчивости
2.3.1 Проведение механической инокуляции растений
2.3.2 Оценка устойчивости образцов Brassica к TuMV
2.3.3 Обнаружение TuMV методом ИФА
2.4 Получение удвоенных гаплоидных растений Brassica
2.4.1 Выращивание допорных растений и сбор бутонов
2.4.2 Изоляция, культивирование и индукция перехода микроспор к эмбриогенезу
2.4.3 Регенерация эмбриоидов
2.4.4 Определение уровня плоидности растений
2.4.5 Удвоение числа хромосом
2.5 Анализ полиморфизма локусов eIF(iso)4E и eIF4E
2.5.1 Выделение суммарной ДНК из растительного материала
2.5.2 Проведение дот-блот гибридизации
2.5.3 Анализ полиморфизма локусов
2.6 Изучение передачи TuMV с семенами растений Brassica
2.6.1 Изучение механизма передачи TuMV .'
2.6.2 Диагностика TuMV методом Холмса
2.6.3 Детекция TuMV методом ПЦР в реальном времени
2.7 Генетический анализ изолята 12 TuMV
2.7.1 Определение и анализ нуклеотидной последовательности генома 12 TuMV..
III РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Определение TuMV с использованием растений-индикаторов и ИФА
3.2 Молекулярно-генетический и филогенетический анализ изолятов TuMV
3.3 Анализ вирулентности изолятов TuMV
3.4 Получение удвоенных гаплоидных линий Brassica — источников устойчивости к TuMV
3.5 Анализ полиморфизма локусов eIF(iso)4E и elF4E у представителей Brassica..
3.6 Анализ возможности передачи TuMV с семенами растений рода Brassica
3.6.1 Подбор растения-индикатора для диагностики TuMV по методике Холмса..
3.6.2 Диагностика TuMV в семенах, зародышах и взрослых растениях
3.6.3 Детекция TuMV методом ПЦР в реальном времени
3.7 Генетический и филогенетический анализ изолята 12 TuMV
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Приложение А

ВВЕДЕНИЕ
Вирус мозаики турнепса (Turnip mosaic virus - TuMV) относится к крупнейшей группе фитопатогенных вирусов семейства потивирусы (Potyviridae) (Shukla, V.l., 1994). Это один из наиболее интересных представителей семейства, так как он инфицирует широкий спектр культурных видов растений, включая все возделываемые виды капустных, а также декоративные, дикорастущие и сорные виды из 156 родов 43 семейств растений (Edwardson, J.R., Christie R.G., 1991). Это наиболее известный представитель рода Potyvirus, поражающий растения семейства Капустные.
При поражении растений происходит задержка в росте, ранняя дефолиация, снижение товарного вида кочанных и салатных форм, что приводит к снижению урожайности и значительным экономическим потерям при выращивании сельскохозяйственных культур видов рода Brassica (Shattuck, V.l., 1992). Во многих странах по экономической вредоносности TuMV стоит на втором месте, уступая лишь вирусу мозаики огурца (Cucumber Mosaic Virus - CMV) (Tomlison, J.A., Carter, A.L., Dale, W.T., et ah, 1970). Его вредоносность резко усиливается при перекрестном заражении с другими вирусами (Camele, I., Nuzzaci, М., Rana, G.L., et al., 1991).
Один из наиболее опасных способов распространения и сохранения вирусной инфекции - передача вируса с семенами, что имеет серьезные последствия, и создает очаги первичной инфекции при посеве/посадке растений в поле. Вирусы могут сохраняться в семени в течение длительного времени и распространяться на большие расстояния (Matthews, 2009). Эффективных химических методов борьбы с вирусными заболеваниями в настоящее время не существует. Больные растения рекомендуется удалять из посадок, своевременно проводить опрыскивание от насекомых-переносчиков (тли), подавлять сорняки и улучшать общие фитосанитарные условия. Естественная устойчивость растений является единственно возможным,

1.2.3 Устойчивость растений к TuMV, определяемая локусами eIF(iso)4E и eIF4E
В последние годы все больше внимания уделяется неспецифической устойчивости растений к Potyvirus и представителям некоторых других групп вирусов {Cucumovirus, Carmovirus и Bymovirus). Для многих систем растение-потивирус была доказана связь между рецессивными генами, отвечающими за неспецифическую устойчивость, и эукариотическим фактором инициации трансляции eIF4F. Фактор eIF4F представлен двумя субъединицами: eIF4E и eIF4G или их изоформами eIF(iso)4E и eIF(iso)4G (Browning, K.S., 1996; Robaglia, C., Caranta, C., 2006). Хотя eIF4E и его изоформа eIF(iso)4E считаются равноценными при трансляции мРНК in vitro, они отличаются по своему характеру экспрессии in vivo и показывают некоторую специфичность по отношению к различным мРНК (Gallie, D.R., Browning, K.S., 2001). Белки eIF4E и eIF(iso)4E в растении выполняют различные функции в обмене веществ и развитии растений. Если eIF4E присутствует во всех тканях, кроме корневой зоны, то eIF(iso)4E в основном встречается в цветке и молодых тканях растения (Rodriguez, С.М., et al., 1998).
Трансляция РНК TuMV в растении-хозяине осуществляется по 5'-зависимому механизму, при этом происходит связывание белка VPg вируса с eIF4F растения (Leonard, S. et al., 2004). В результате мутаций в eIF4E или eIF(iso)4E, реже в elF4G или eIF(iso)4G, инициация трансляции вирусной РНК не происходит и растение не инфицируется (Lellis, A.D. et al., 2002; Robaglia, C., Caranta, C., 2006).
Примерами такой устойчивости растений к вирусам являются: pvr2 и pvrl устойчивости перца к нескольким потивирусам (Kang, B.C. et al., 2005; Ruffel, S. et al., 2002, 2004), sbm-l устойчивости гороха к PSbMV (Johansen,
I.E. et al., 2001), pot-1 устойчивости томата к PVY и TEV (Ruffel, S. et al., 2005) и другие (таблица 3).