Сравнительная характеристика нативного и рекомбинантного лигнолитического фермента - лакказы

• Автор: Логинов, Дмитрий Сергеевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 122 с. : ил.

Оглавление
Оглавление
Список сокращений
1. Введение
2. Литературный обзор
2Л. История исследования лакказ
2.2. Распространение в природе и физиологические функции лакказ
2.3. Общая характеристика лакказ
2.4. Структура и строение активных центров лакказ
2.5. Субстратная специфичность лакказ
2.6. Механизмы катализа
2.7. Биосинтез лакказ
2.8. Использование лакказ в биотехнологии
2.9. Геномная организация лакказ
2.10. Экспрессия грибных лакказ
3. Материалы и методы
3.1. Материалы
3.1.1. Штаммы микроорганизмов и ферменты
3.1.2. Носители
3.1.3. Реагенты
3.2 Методы
3.2.1 Культивирование штаммов продуцентов лакказы
3.2.2 Получение антигена - дегликозилированной лакказы (Lacl)
3.2.3 Иммунизация
3.2.4 Тестирование антисывороток методом непрямого ИФА
3.2.5 Измерение пероксидазной активности в твердофазных системах
3.2.6 Очистка поликлональных антител
3.2.7 Определение специфичности полученных препаратов антител
3.2.8 Синтез конъюгатов, меченых пероксидазой хрена (ПХ)
3.2.9 Вестерн блоттинг

3.2.10 Выделение рекомбинантной лакказы
3.2.1 Юпределение активности лакказы
3.2.12 Определение концентрации белка
3.2.13 Оценка гомогенности препаратов и определение молекулярной массы
3.2.14 Определение изоэлектрической точки
3.2.15 Спектральная характеристика
3.2.16 Регистрация ЭПР-спектров лакказы
3.2.17 Определение количества углеводов
3.2.18 Определение температурного и рН-оптимумов активности лакказ и изучение их термостабильности
3.2.19 Дифференциальная сканирующая калориметрия
3.2.20 Определение кинетических параметров
3.2.21 Подбор и оптимизация условий кристаллизации рекомбинантной лакказы
3.2.22 Сбор кристаллографических данных и их обработка
3.2.23 Визуализация белковых структур
3.2.24 Динамическое светорассеяние
3.2.25 Расчет модели взаимодействия нативной и рекомбинантной лакказ с субстратом АБТС
4. Результаты и их обсуждение
4.1. Разработка метода иммунодетекции лакказ
4.2. Выделение нативной и рекомбинантной лакказ
4.3. Изучение спектральных характеристик лакказ
4.4. Сравнительная характеристика физико-химических свойств нативного и рекомбинантного ферментов
4.4.1 рН-оптимум
4.4.2 Термооптимум
4.4.3 Термостабильность
4.4.4 Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК)
4.5 Каталитические свойства рекомбинантной лакказы
4.6 Сравнительное изучение трехмерных структур рекомбинантной лакказы из Р. сапевсет и нативной лакказы из Т
4.6.1 Решение и уточнение структуры рекомбинантной лакказы
4.6.2 Сравнение последовательностей нативной и рекомбинантной лакказ
4.6.3 Сравнение пространственных структур нативной и рекомбинантной лакказ
4.6.4 Сравнение активного центра нативной и рекомбинантной лакказ
4.6.5 Образование димерной формы
4.6.6 Расчетная модель взаимодействия нативной и рекомбинантной лакказ с субстратом АБТС
5. Выводы
6. Список литературы

Как видно из рисунка, биосенсор второго типа представляет собой электрод, на котором сорбирован антиген или гаптен. При взаимодействии антитела, меченного лакказой, с антигеном происходит образование молекулярного трансдуцера, с сопутствующей генерацией под действием лакказы высокого электродного потенциала. Таким образом, происходит сдвиг значения потенциала электрода до иммуновзаимодействия и после в среднем на 400 мВ. Этот сдвиг является характеристикой поверхности электрода, покрытой лакказным иммуноконъюгатом. Следовательно, этот показатель может служить в качестве количественной характеристики иммуновзаимодействия, протекающего на поверхности электрода. Важно отметить, что конъюгат, находящийся в растворе, а не на поверхности электрода, не способен катализировать перенос электронов и не влияет на величину потенциала [93].
Биосенсорами третьего типа являются пьезоэлектрические сенсоры. Сенсоры этого типа основаны на эффекта резонанса, возникающем на поверхности кварцевого кристалла, покрытого золотом или биологическим объектом, при наложении внешнего переменного электрического поля (рис. 8) [94].
Рис. 8. Схема пьезоэлектрического иммунокристалла.