Изучение механизмов лекарственной устойчивости ВИЧ-1 к ингибиторам обратной транскриптазы

• Автор: Николенко, Галина Николаевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 182 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1.1. Актуальность темы
1.2. Цель и задачи исследования
1.3. Научная новизна и практическая значимость работы
1.4. Положения, выносимые на защиту
1.5. Апробация работы
1.6. Структура и объем диссертации
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Обшая характеристика вируса иммунодефицита человека типа
2.2. Структура и функции обратной транскриптазы ВИЧ-
2.3. Нуклеозидные и ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы
2.4. Механизмы лекарственной устойчивости к NR.Tr
2.4.1. Механизм дискриминации и характерные лекарственно-устойчивые
мутации
2.4.1.1. М1841/У и ее роль в лекарственной устойчивости
2.4.1.2. Ь74У и устойчивость к дидеоксинуклеотидным аналогам
2.4.1.3. К6511 и устойчивость к тенофовиру
2.4.1.4. Комплекс С?151М и множественная лекарственная
устойчивость
2.4.2. Механизм фосфоролиза и характерные лекарственно-устойчивые
мутации
2.4.2.1. Молекулярные аспекты реакции фосфоролиза
2.4.2.2. Мутации, специализирующиеся в реакции фосфоролиза
2.4.3. Антагонизм мутаций, способствующих дискриминации нуклеозидного аналога,
и мутаций с усиленной способностью к фосфоролизу
2.5. Механизмы приобретения устойчивости к №Л1Т1 и характерные лекарственноустойчивые мутации
2.6. Взаимодействие мутаций, селектированных к разным классам ингибиторов (№ХП и №ЛШ)
2.7. Роль вирусной РНКазы в лекарственной устойчивости к МЯТ! и NN11X
2.7.1. Функции вирусной РНКазы в процессе обратной транскрипции
2.7.2. Новый механизм лекарственной устойчивости к NRTI, обусловленный
мутациями в С-концевом районе обратной транскриптазы

2.7.3. Механизм перекрестной лекарственной устойчивости к нуклеозидным и
ненуклеозидым аналогам, обеспечиваемый мутациями С-концевого района обратной
транскриптазы
2.8. Заключение
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Материалы
3.1.1. Плазмиды
3.1.2. Штаммы Escherichia coli
3.1.3. Питательные среды для бактерий
3.1.4. Буферные растворы
3.1.5. Культуры эукариотических клеток
3.1.6. Ингибиторы обратной транскриптазы
3.1.7. Олигонуклеотиды и пробы для ЦС-ПЦР и ПЦР в реальном времени
3.1.8. Клинические образцы
3.2. Методы
3.2.1. Мутагенез и клонирование
3.2.2. Амплификация гена обратной транскриптазы ВИЧ-
3.2.3. Культивирование эукариотических клеток
3.2.4. Трансфекция
3.2.5. Приготовление вируса
3.2.6. Определение эффективности вирусной репликации
3.2.7. Создание клеточных линий
3.2.8. Определение частоты смены матрицы
3.2.9. Определение частоты мутирования
3.2.10. Окрашивание клеток X-gal
3.2.11. Изоляция индивидуальных нефлуоресцентных клонов, выделение геномной
ДНК, амплификация и секвенирование провирусной ДНК
3.2.12. Определение чувствительности вируса к лекарственным препаратам
3.2.13. Инфицирование клеток и приготовление образцов для ЦС-ПЦР анализа
3.2.14. ЦС- ПЦР анализ количества копий специфической цепи вирусной ДНК
3.2.15. Мечение РНК и ДНК олигонуклеотидов радиоактивным фосфором и
приготовление субстрата для in vitro реакций
3.2.16. Определение активности вирусной РНКазы
3.2.17. Сопряженная реакция фосфоролиза и полимеризации
3.2.18. Статистический анализ
L РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. Новый ЦС-ПЦР анализ для определения количества копий специфической ДНК цепи
4.1.1. Стратегия разработки нового ЦС-ПЦР анализа
4.1.2. Характеризация нового ЦС-ПЦР анализа: эффективность, чувствительность и воспроизводимость
4.1.3. Исследование кинетики специфических стадий обратной
транскрипции
4.1.4. Исследование влияния антивирусных препаратов на кинетику обратной транскрипции
4.2. Исследование свойств обратной транскриптазы, влияющих на рекомбинацию: частоты смены матрицы и точности копирования
4.2.1. Разработка функционального in vivo теста для исследования частоты смены матрицы обратной транскриптазы ВИЧ-
4.2.2. Влияние баланса между полимеризацией и активностью РНКазы на частоту смены матрицы
4.2.3. Разработка функционального in vivo теста для исследования точности копирования генома
4.2.4. Влияние баланса между полимеризацией и активностью РНКазы на точность копирования
4.2.5. Влияние аминокислот захватывающего праймер участка РНКазы на точность копирования ретровирусов ВИЧ-1 и вируса лейкемии мыши (MLV)
4.3. Новый механизм лекарственной устойчивости к нуклеозидным и ненуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы ВИЧ-
4.3.1. Новый механизм устойчивости к нуклеозидным ингибиторам
4.3.1.1. Модельные мутации и вирусы со сниженной активностью РНКазы и лекарственная устойчивость к нуклеозидным ингибиторам AZT и d4T
4.3.1.2. Генотипический и фенотипический анализ С-концевых районов обратной транскриптазы из вирусов пациентов, прошедших антивирусную терапию
4.3.1.3. Идентификация мутаций С-концевого района обратной транскриптазы, увеличивающих резистентность ВИЧ-1 kNRTI
4.3.1.4. Новые лекарственно-устойчивые мутации коннектора обратной транскриптазы снижают активность РНКазы in vivo и in vitro

синтезированную ДНК, которая теперь становится доступной для использования в качестве матрицы для синтеза второй цепи ДНК - «плюс»-цепи.
Полимеразная и РНКазная активности функционально взаимосвязаны. Во время синтеза «минус»-цепи ДНК вирусная РНКаза начинает деградацию РНК-генома (такую активность РНКазы называют зависимой от полимеризации) (Furfme and Reardon, 1991; Peliska and Benkovic, 1992). Однако в силу того, что скорость полимеризации значительно выше, чем скорость зависимого от полимеризации гидролиза РНК (DeStefano et al., 1991; Kati et al., 1992), этой активности РНКазы недостаточно для полной деградации РНК-генома (DeStefano et al., 1994; Kati et al., 1992). Обратная транскриптаза обладает также способностью гидролизовать геномную РНК, оставшуюся связанной с «минус»-цепью ДНК, независимо от полимеризации (такую активность РНКазы называют «независимой от полимеризации») (Wisniewski et al., 2000). Деградация РНК-генома путем независимой от полимеризации активности РНКазы, а также вытесняющей полимеризации — важное звено в обеспечении эффективного синтеза «плюс»-цепи ДНК (DeStefano et al., 1994; DeStefano et al., 1992; Fuentes et al., 1996; Smith et al., 1999). Независимая от полимеризации активность РНКазы необходима для формирования праймера в районе полипуринового тракта (РРТ), где происходит инициация синтеза «плюс»-цепи ДНК (Huber and Richardson, 1990; Luo et al., 1990). Кроме того, РНКазная активность необходима для удаления тРНК и РРТ-праймера после их использования. Существует множество примеров, указывающих на необходимость четкой координации между скоростью полимеризации, с одной стороны, и активностью и специфичностью вирусной РНКазы во время обратной транскрипции - с другой. Например, усиленная бесконтрольная деградация РНК-матрицы может приводить к преждевременной диссоциации праймера и терминации синтеза. С другой стороны, ослабленная активность РНКазы может способствовать замедлению синтеза «плюс»-цепи ДНК из-за присутствия остатков РНК-матрицы на «минус»-цепи, а изменение специфичности вирусной РНКазы может влиять на формирование РРТ-праймера и его последующее удаление, приводя к формированию нефункциональных концевых повторов вирусного генома. Необходимость переноса синтезированной ДНК-цепи с РНК-матрицы в процессе вирусной репликации также требует строго координированного взаимодействия полимеразной и РНКазной активности обратной транскриптазы. Аминокислоты полимеразного домена могут влиять на структуру РНКазного домена и его функции как непосредственно, так и опосредованно: через взаимодействие с нуклеиновой кислотой. Так, изолированный домен РНКазы не активен, однако его нуклеазная активность восстанавливается в присутствии субъединицы р51 или поддоменов «большой палец» и коннектор (Smith et al., 1994). Другой пример - это