Иммобилизованные биокатализаторы для деструкции фосфорорганических соединений и продуктов их разложения

• Автор: Сироткина, Мария Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.06, 02.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 171 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ОРН - органофосфатгидролаза
Швб-ОРН - органофосфатгидролаза, содержащая гексагистидиновую последовательность на ТМ-конце молекулы белка
АЫА - Ы-ацилгомосеринлактоназа из клеток К1юс1ососсш егуЛгороИх У2 БвоРох - ]М-ацилгомосеринлактоназа из гипертермофильных архей Зи1/о1оЪи$ зо1/Шапст
ГОА - иминодиуксусная кислота АТФ - аденозинтрифосфат ДСН - додецилсульфат натрия
СНЕБ -2-рЧ-циклогексиламино]этансульфоновая кислота
ИПТГ - изопропил-рГО-галактотиопиранозид
ДФФ - диизопропилфторфосфат
ФОС - фосфорорганические соединения
ФОБ - фосфорорганические отравляющие вещества
ФОП — фосфорорганические пестициды
ПДК - предельно допустимая концентрация
АГЛ - ТчГ-ацилгомосеринлактоп
ПАВ - поверхностно-активное вещество
ИФБК - иммобилизованный ферментный биокатализатор
ИМК - иммобилизованный микробный консорциум
МФК - метилфосфоновая кислота
ИБЭМФК - изобутиловый эфир метилфосфоновой кислоты ИПЭМФК - изопропиловый эфир метилфосфоновой кислоты ДИБЭМФК - диизобутиловый эфир метилфосфоновой кислоты Г(-)-клетки бактерий - грамотрицательные клетки бактерий Г(+)-клетки бактерий - грамположительные клетки бактерий УВ - углеводород ПНФ — п-нитрофенол ПВС - поливиниловый спирт ПА АГ - полиакриламидный гель

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Проблема загрязнения почвогрунтов ФОС
1.1.1 Оценка экологической ситуации, связанной с накоплением ФОС в
почвогрунтах
1Л .2 Запрещенные и непригодные к использованию запасы пестицидов
1.2 Методы очистки почв от загрязнений
1.2.1 Детоксификация почвогрунтов с использованием ферментов
1.2.1.1 Иммобилизация ферментов для детоксификации почвогрунтов
1.2.1.2 Фермент органофосфатгидролаза и его физико-химические 23 характеристики
1.2.1.3 Гексагистидинсодержагцая органофосфатгидролаза
1.2.2 Детоксификация почвогрунтов с помощью клеток микроорганизмов
1.2.2.1 Методы стабилизации и повышения эффективности действия 34 клеток микроорганизмов в почвогрунте. Кворум-зависимые бактериальные системы
1.2.2.1.1 Кворум-зависимые системы у грамотрицательных клеток 35 бактерий
1.2.2.1.2 Ферментативное разрушение автоиндукторов «кворумного 37 ответа» у грамотрицательных клеток бактерий
1.2.2.2 Методы стабилизации клеток микроорганизмов в почвогрунте. 39 Иммобилизация клеток микроорганизмов
1.2.2.3 ФОС-деградирующий потенциал клеток бактерий 40 Pseudomonas sp. 78Г
2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1 Материалы и приборы
2.1.1 Реактивы
2.1.2 Бактериальные штаммы
2.1.3 Питательные среды
2.1.5 Приборы
2.2 Методы
2.2.1 Экспрессия и выделение His6-OPH
2.2.2 Подготовка крио-ПААГ носителей для выделения Hisa-OPH
2.2.3 Определение концентрации белка

2.2.4 Электрофоретический анализ белков в полиакриламидном геле
2.2.5 Обработка данных электрофореза
2.2.6 Кинетические исследования реакции гидролиза параоксона, 48 катализируемой His6-OPH
2.2.7 Иммобилизация фермента His6-OPH
2.2.8 Определение активности иммобилизованного фермента Hise-OPH
2.2.9. Исследование термостабильности, температурного и рН-оптимума
иммобилизованного ферментного биокатализатора, полученного на основе His6-OPH
2.2.10 Щелочная делигнификация целлюлозосодержащих носителей
2.2.11 Разложение ФОС в почвогрунтах под действием иммобилизованной 51 Hisg-OPH
2.2.12 Хроматографический анализ ФОС
2.2.13 Определение концентрации фосфат-ионов в почвогрунте
2.2.14 Иммобилизация клеток микроорганизмов в криогель поливинилового 53 спирта
2.2.15 Определение концентрации внутриклеточного АТФ в свободных и 53 иммобилизованных клетках биолюминесцентным методом
2.2.16 Иммобилизованные клетки E.coli SG13009[pREP4] как инокулят для 53 получения клеток с [йЗб-ОРН-активпостыо
2.2.17 Определение концентрации глицерина в реакционной среде
2.2.18 Иммобилизованные и свободные клетки бактерий в процессе 54 деградации ФОП и продуктов их разложения
2.2.19 Определение кинетических параметров роста свободных клеток 55 бактерий
2.2.20 Контроль интенсивности аэрации среды
2.2.21 Окрашивание клеток микроорганизмов по Граму
2.2.22 Функционирование разработанного бактериального консорциума в 58 системе параоксон-гексадекан
2.2.23 Детоксификация песчаного почвогрунта под действием консорциума, 58 составленного на основе клеток бактерий P. esterophilus и R. ruber АС-1513D
2.2.24 Хроматографический анализ гексадекана
2.2.25 Определение влажности экспериментальных образцов
2.2.26 Кинетические исследования реакции гидролиза 60 N-ацилгомосеринлактонов под действием фермента His6-OPH и клеток

правило, в качестве молекул-автоиндукторов используют короткоцепочечные пептиды, а грамотрицательные (Г(-)) бактерии - М-апилгомоссринлактоны [138-139].
1.2.2.1.1 Кворум-зависимые системы у грамотрицательных клеток бактерий
Детальный анализ Таблицы 11 показал, что большинство бактерий, применяемых для деградации ФОС в почвах, относятся к Г(-) микроорганизмам. В связи с этим информация о механизме формирования «кворумного ответа» у данной группы микроорганизмов наиболее интересна с целью получения эффективного деструктора ФОС на основе Г(-) клеток бактерий.
В качестве индукторов «квормуного ответа» у Г(-) микроорганизмов выступают М-ацилгомосеринлактоны (АГЛ), общая формула которых - следующая:
, где О или Н; К2: СНз - С10Н21.
Природные АГЛ отличаются друг от друга длиной ацильного радикала, а также наличием или отсутствием в нем оксо-группы. Стоит отметить, что «кворумный ответ» у определенных Г(-)-клеток бактерий могут инициировать только соответствующие им молекулы АГЛ [133, 138-139].
Кворум-зависимые системы регуляции были обнаружены у большинства видов Г(-)-бактерий, которые продуцируют различные по строению АГЛ (Табл. 12) [133, 138-139]. При этом в большинстве случаев в ходе реализации «кворумного ответа» повышается общая устойчивость клеток бактерий к внешним неблагоприятным факторам [140].
Таблица 12. Примеры Г(-)-клеток бактерий, обладающих системой «кворумного ответа»[ 133, 138-139].
Микроорганизм N-ацилгомосеринлактон «Кворумный ответ»
Аеготопай Ъус1горЫ1а Аеготопая т1топтАа М-бутирилгомосерин- лактон Биосинтез внеклеточных протеаз, формирование биопленок, повышенная устойчивость
AgroЪacterium Ште/аает С58 Agrobacterium 1гппе[ас1еп.ч К10 N43- оксооктацил)гомосерин- лактон Конъюгация
ВигккоЫепа glumae М-гексилгомосерин-лактон, Т4-октацилгомосеринлактон Биосинтез липида А и фитотоксина, токсофлавина, повышенная устойчивость
СкготоЬаМегкпп nolaceum М-гексилгомосеринлактон Биосинтез экзоферментов, антибиотиков, цианида, виолацеина, повышенная