Физико-химические свойства хромофора GFP и флуоресцентные красители на его основе

• Автор: Баранов, Михаил Сергеевич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 161 с. : ил.

Содержание
Содержание
Введение
Глава I. Литературный обзор
1. Основные структурные классы флуоресцентных красителей
1.1 Полиароматические соединения
1.2 Производные нафталинсульфоновой и нафталинкарбоновой кислот
1.3 Кумариновые красители
1.4 Производные родамина и флуоресцеина (ксантеновые красители)
1.5 Метановые красители
1.5.1 Цианиновые красители
1.5.2 ВСЖ1РУ
1.6 Заключение
2. Хромофоры флуоресцентных белков. Синтетический взгляд
2.1 Синтез оксазолонов
2.1.1 Конденсация карбонильных соединений с производными Ы-ацилглицина .
2.1.2 Прочие методы синтеза оксазолонов
2.2 Синтез производных >1-ацилдегидроаминокислот
2.2.1 Нуклеофильное раскрытие оксазолонов
2.2.2 Прочие методы синтеза амидов >1-ацилдегидроаминокислот
2.3 Методы синтеза имидазолонов
2.3.1 Циклизация амидов 11-ацилдегидроаминокислот
2.3.2 Прочие методы синтеза имидазолонов
2.4 Заключение
Глава И. Экспериментальная часть
1. Материалы и оборудование
2. Синтез
2.1 Получение имидазолонов на основе производных 2-азидокоричных кислот..
2.2 Производные оксазол-4-карбоновых кислот
2.3 Конденсация ароматических альдегидов с эфирами нитроуксусной кислоты.
2.4. Получение борированных производных без линкеров
2.5. Получение борированных производных с линкерами
Глава III. Результаты и обсуждение
Подходы к созданию флуоресцентных аналогов хромофора вГР
1. Роль заместителей во 2 положении
2. Производные оксазол-4-карбоновых кислот
3. Производные 1,2-оксазин-З-карбоновых кислот

4. Борированный аналог хромофора СБР с фиксированной геометрией
4.1 Синтез
4.2 Свойства
Флуоресцентные красители на основе борированного аналога хромофора ОБР
5. Аминопроизводные
5.1 Синтез
5.2 Свойства
5.3 Применение
6. Фторпроизводные
6.1 Синтез
6.2 Свойства
7. Флуоресцентные красители с линкерными заместителями
7.1 Синтез
7.2 Применение
7.2.1 Флуоресцентно-меченый ингибитор катепсинов человека
7.2.1 Флуоресцентно-меченый диолеилфосфатидилэтаноламин
Выводы
Благодарности
Список сокращений и условных обозначений
Список литературы

Введение
Современные технологии флуоресцентной микроскопии позволили визуализировать многие биологические процессы. Одним из важнейших инструментов подобных исследований, применимых как для прикладных биомедицинских анализов, так и для научных задач, являются флуоресцентные красители, дающие возможность проводить наблюдение за целевыми молекулами и средами в режиме реального времени.
Использование живых систем наложило множество дополнительных ограничений на строение подобных веществ. Такие красители должны быть достаточно гидрофильны (для исключения неспецифических гидрофобных взаимодействий), их спектр поглощения и испускания должен лежать в видимой, по возможности более красной области (для уменьшения фототоксичности и фоновой авто флуоресценции), а молекулярный вес должен быть наименьшим (для уменьшения влияния на меченые биомолекулы).
Очевидно, что не существует веществ, идеально удовлетворяющих всем этим условиям. В связи с этим, важной задачей, стоящей перед современными химиками является разработка новых флуоресцентных красителей.
Одним из потенциальных претендентов на эту роль является хромофор зеленого флуоресцентного белка (СРР). Это соединение обладает достаточно высоким коэффициентом молярного поглощения, а также имеет небольшую молекулярную массу и высокую гидрофильность. Однако, в отличие от флуоресцентных белков, синтетический хромофор СИ Р совершенно лишен флуоресцентных свойств.
Настоящая работа посвящена выявлению взаимосвязи между строением и флуоресцентными свойствами ряда аналогов хромофора зеленого флуоресцентного белка, а также синтезу новых высокофлуоресцентных производных и созданию серии флуоресцентных красителей на их основе. В рамках исследования были предложены методы синтеза различных аналогов хромофора вИР, изучены свойства полученных соединений и показано ключевое влияние подвижности бензилиденового фрагмента на флуоресцентные свойства хромофора.
Предложенный в работе метод создания борированных аналогов позволил впервые получить близкие производные хромофора ОРР, обладающие высокими квантовыми выходами флуоресценции. С использованием разработанной методики был синтезирован ряд высокофлуоресцентных аналогов хромофора, различающихся по своим оптическим свойствам, а также способных связываться с различными биологическими субстратами. Изучение полученных веществ, а также их конъюгатов, показало перспективность использования подобных соединений в роли флуоресцентных маркеров.

Ar NH

PhCOCI
Аг NHCOPh

Н COOR Ру, 100°С Н COOR
Н CONHR CONHR
CONHR
Схема 48. Реакции незамещенных дегидроаминокислот
В связи с этим, более успешными являются альтернативные методы, в которых формирование двойной связи происходит после ацилирования атома азота.
Ключевым из подобных подходов является отщепление молекулы воды от 3-гидрокси производных N-ациламинокислот. Активирование гидроксигруппы для последующего элиминирования может быть проведено такими сочетаниями реагентов. как дихлороацетилхлорид/триэтиламин [110], тозилангидрид/ДАБКО [111], трифенилфосфин/ ДЕАД [112], диэтиламинотрифторид серы/ДИПЭА [113], а также действием различных карбодиимидов в присутвии солей меди (I) [114] или же действием КДИ [115]. Интересным примером является использование Вос20, которое сопровождается введением защитной группы [116]. Стереоселективных результатов элиминирования удается достичь при использовании тионилхлорида в присутствии сильного основания [117], так как образующееся при этом циклическое серное производное определяет последующую конфигурацию продукта (Схема 49).
В качестве альтернативы 3-гидроксипроизводным, могут быть использованы их серные [118] или селеновые [119] аналоги. В подобном случае реакции проводится не по механизму простого элиминирования, а включает в себя окислительный процесс. Особенно эффективен этот подход может быть при использовании полимерного носителя (Схема 50) [120]:
р02Вп
60-75%
Схема 49. Реакции элиминирования в синтезе N-ацилдегидроаминокислот