Антибактериальное, в том числе антимикобактериальное, действие экзогенного кардиолипина

• Автор: Микулович, Юлия Львовна
• Шифр специальности: 03.01.06, 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 132 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
1. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
2. ВВЕДЕНИЕ
3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
3.1. Структура клеточной оболочки Mycobacterium tuberculosis и
фосфолипидный состав микобактерий
3.2. Структура клеточной оболочки Escherichia coli и фосфолипидный состав бактерий
3.3. Кардиолипин
3.3.1. Исторический очерк
3.3.2. Локализация
3.3.3. Структура и свойства
3.3.4. Метаболизм в прокариотических клетках
3.3.4.1. Биосинтез
3.3.4.2. Катаболизм
3.3.5. Неравномерное распределение в бактериальных мембранах
с образованием доменов
3.3.6. Взаимодействие с бактериальными мембраносвязанными белками
в различных процессах клеточного цикла
3.3.6.1. Репликация ДНК
3.3.6.2. Деление клетки
3.3.6.3. Транспорт белков и других веществ
3.3.6.4. Дыхание клетки
3.3.6.5. Образование спор
3.3.7. Ингибирующее действие на ферменты
3.4. Основные группы антибиотиков, их мишени и механизмы действия
3.4.1. Ингибиторы репликации ДНК
3.4.2. Ингибиторы синтеза РНК
3.4.3. Ингибиторы синтеза клеточной стенки
3.4.4. Ингибиторы синтеза белков
4. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Характеристика полученных липосом на основе кардиолипина и исследование их стабильности при хранении
4.2. Влияние липосом из кардиолипина на рост чувствительного к противотуберкулезным препаратам лабораторного штамма М. tuberculosis H37R.V
4.3. Влияние липосомального кардиолипина на рост резистентных штаммов М. tuberculosis
с множественной и широкой лекарственной устойчивостью
4.4. Действие экзогенного липосомального кардиолипина на рост грамотрицательных и грамположительных бактерий, не относящихся к роду Mycobacterium

4.5. Анализ эндогенных фосфолипидов Mycobacterium tuberculosis H37Rv в разных
фазах роста (логарифмической, ранней и поздней стационарной)
4.6. Выявление механизма бактерицидного действия экзогенного липосомального кардиолипина
4.6.1. Исследование стабильности липосом из кардиолипина в условиях роста
М. tuberculosis
4.6.2. Получение лизо- и бислизокардиолипина, фосфатидной кислоты и исследование их влияния на рост М. tuberculosis H37Rv
4.6.2.1. Получение лизопроизводных кардиолипина
4.6.2.2. Получение фосфатидной кислоты полусинтезом с использованием фосфолипазы D
4.6.2.3. Определение критических концентраций мицеллообразования кардиолипина и продуктов его деструкции
4.6.2.4. Изучение влияния лизо- и бислизокардиолипина, фосфатидной и
линолевой кислот на рост М. tuberculosis H37Rv
4.6.3. Установление возможных механизмов бактерицидного действия экзогенного липосомального кардиолипина на Е. coli
4.6.3.1. Выявление мишеней кардиолипина
4.6.3.2. Влияние кардиолипина на реакции, катализируемые топоизомеразой I и ДНК-гиразой из Е. coli, in vitro
4.6.3.3. Оценка содержания супероксид анион-радикалов в клетках Е. coli в присутствии липосомального кардиолипина
4.6.4. Исследование жизнеспособности клеток Е. coli и М. tuberculosis при культивировании с летальными концентрациями кардиолипина
в присутствии антиоксидантов
5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
5.1. Материалы и оборудование
5.2. Методы
5.2.1. Получение липосом
5.2.2. Определение степени окисления кардиолипина
5.2.3. Идентификация продуктов деструкции кардиолипина методами ТСХ и MALDI-TOF масс-спектрометрии после его инкубации в бульоне Дюбо
5.2.4. Получение лизо- и бислизокардиолипина
5.2.5. Получение фосфатидной кислоты полусинтезом с использованием фосфолипазы D
5.2.6. Определение критических концентраций мицеллообразования липидов

5.2.7. Исследования на Mycobacterium tuberculosis
5.2.7.1. Получение стандартизованной по генотипу, лекарственной чувствительности, фазе роста и колониеобразующим единицам культуры чувствительного к противотуберкулезным препаратам и резистентных штаммов Mycobacterium tuberculosis с множественной и широкой лекарственной устойчивостью
52.1.2. Влияние экзогенного липосомального кардиолипина на рост
чувствительного к противотуберкулезным препаратам и резистентных штаммов М. tuberculosis
5.2.7.2.1. Культивирование М. tuberculosis в авоматизированной системе
ВАСТЕС MGIT
5.2.1.22. Оценка роста М. tuberculosis методом ПЦР в реальном времени
5.2.122. Определение жизнеспособности М. tuberculosis культуральным
методом (подсчет КОЕ)
5.2.7.2.4. Оценка жизнеспособности М. tuberculosis микроскопией
с окразкой мазков по методу Мурохаши
5.2.7.2.5. Определение жизнеспособности М. tuberculosis методом ПЦР
с обратной транскрипцией по количеству мРНК
52.12.6. Регистрация ростаМ tuberculosis в присутствии липосомального
кардиолипина и антиоксиданта
5.2.12. Оценка роста М. tuberculosis H37Rv при культивировании с лизо- и
бислизокардиолипином, фосфатидной и линолевой кислотами
5.2.7.4. Анализ эндогенных фосфолипидов М. tuberculosis H37Rv
в разных фазах роста
5.2.7.4.1. Культивирование М. tuberculosis H37Rv
5.2.7.4.2. Экстракция липидов из клеток М. tuberculosis H37Rv, находящихся
в разных фазах роста
5.2.7.4.3. Количественный анализ фосфолипидов в полученных
экстрактах липидов
5.2.7.4.3.1. Определение липидного фосфора модифицированным методом Бартлета
5.2.7.4.3.2. Определение содержания фосфолипидов денситометрией
5.2.8. Определение жизнеспособности стрептококков и стафилококков при культивировании с липосомальным кардиолипином методом подсчета КОЕ
5.2.9. Исследования на Escherichia coli
5.2.9.1. Оценка жизнеспособности Escherichia coli при культивировании с липосомальным кардиолипином в отсутствие и в присутствии антиоксидантов

отличие от E.coli, где КЛ лучше ФГ способствует диссоциации АТФ из комплекса с DnaA, было показано, что в S. aureus именно ФГ, а не KJI способствует лучшей диссоцицации нуклеотидов.
Цвиттерионный фосфолипид - ФЭ - также ингибирует диссоциацию АТФ, опосредованную фосфатидилглицерином, причем для ингибирования требуются большие его концентрации, чем лизилФГ. Эти результаты свидетельствуют о том, что взаимодействие белка DnaA с кислыми фосфолипидами можно регулировать, изменяя фосфолипидный состав клеточной мембраны в разных фазах роста.
В E.coli [81] и S. aureus [81] для реактивации белка DnaA кислыми фосфолипидами важна текучесть мембраны, потому что процесс зависит от наличия ненасыщенных жирных кислот в составе липидов, а также от температур — они должны быть выше температуры фазового перехода мембран.
Известно, что КЛ обладает способностью связываться также с другим важным ферментом, участвующим в репликации ДНК - ДНК-полимеразой 111 [69]. Так, в ранней работе [69] есть сведения о том, что КЛ способствует синтезу ДНК в E. coli с помощью ДНК-полимеразы III, однако роль КЛ в этой реакции не была установлена. Таким образом, КЛ необходим для нормальной работы данного фермента.
3.3.6.2. Деление клетки
В работе [70] было изучено влияние липидного состава на взаимодействие белка MinD из E.coli с мембраной in vitro и in vivo. Периферийный мембранный АТФ-азный белок MinD -это компонент MinCDE-системы, ответственной за правильное расположение центра деления клетки в E.coli. Быстро перемещаясь от одного полюса клетки к другому, MinD помогает блокировать нежелательные образования септы у полюсов клетки. Во время вегетативного роста клеточное деление палочковидных бактерий происходит в центре клетки. На начальном этапе деления происходит процесс полимеризации тубулин-подобного белка FtsZ в середине клетки в кольцевую структуру, названную Z-кольцом. В отсутствие Min-системы Z-кольца образуются в середине клетки, а также в ее полюсах. Расположение центра деления клетки в ее полюсах приводит к образованию миниклеток, которые являются продуктом ненормального деления клетки и не содержат ДНК. MinD, связанный с АТФ, прикрепляется к мембране, затем с ним взаимодействуют белки MinE и MinC. Присоединение белка MinE к MinD приводит к гидролизу АТФ и высвобождению MinD в цитоплазму, в результате чего MinD быстро перемещается от одного полюса клетки к другому - осциллирует. MinC - это специфический ингибитор образования Z-кольца. Поскольку MinC присоединяется к MinD, движение MinC от полюса к полюсу с относительно длительными временами полюсного пребывания и коротким временем движения блокирует образование полюсных, но не центральных Z-колец. Следовательно, АТФ-азная активность MinD обеспечивает движущую силу для осцилляции от полюса к полюсу ингибитора деления MinC.