Разработка и совершенствование средств и методов оценки эффективности вакцин против бешенства

• Автор: Недосеков, Виталий Владимирович
• Шифр специальности: 16.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Покров
• Количество страниц: 182 с.

Содержание
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1 Современная молекулярная биология вируса бешенства
2.2. Антирабические вакцины
2.3. Контроль антирабических вакцин
2.3.1. Общие положения
2.3.2. Методы оценки антирабических инактивированных вакцин
2.3.2.1. Метод Национальных Институтов Здоровья (NIH)
2.3.2.2. Методы определения антигенной активности инактивированных вакцин
in vitro >
2.3.3. Методы определения уровня вируснейтрализующих антител
2.3.3.1, Реакция нейтрализации in vivo
2.3.3.2. Методы определения вируснейтрализующих антител in vitro
2.4. Моноклональные антитела
2.4.1. Теоретические аспекты получения моноклональных антител
2.4.2. Использование моноклональных антител для изучения бешенства
2.5. Заключение по обзору литературы
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Материалы
3 .1.1. Вирусы и вакцины
3.1.2. Животные
3.1.3. Культуры клеток
3.1.4. Сыворотки
3.1.5. Питательные среды и растворы
3.1.6. Реактивы
3.1.7. Оборудование
3.2. Методы
3.2.1. Получение и титрование вируссодержащего материала
3.2.2. Приготовление специфических и нормальных антигенов вируса бешен-

ства
3.2.3. Методы определения иммуногенности инактивированных антирабиче-
ских вакцин
3.2.4. Получение моноклональных антител
3.2.4.1. Иммунизация и контроль иммунного ответа у мышей
3.2.4.2. Гибридизация и клонирование гибридных клеток
3.2.4.3. Скрининг гибридом, продуцирующих вирусспецифические моноклональные антитела
3.2.4.4. Криоконсервирование и восстановление гибридных клеток после хранения в жидком азоте
3.2.4.5. Получение иммуноасцитической жидкости мышей
3.2.4.6. Очистка моно-и поликлональных антител
3.2.4.7. Коньюгирование моно-и поликлональных антител с пероксидазой хрена
и ФИТЦ
3.2.4.8. Лиофилизация препаратов
3.2.4.9. Определение полипептидной специфичности МКА методами иммуноб-
лотинга и радиоиммунопреципитации
3.2.5. Получение поликлональных специфических антител
3.2.6. Постановка прямого варианта ТФ ИФА на основе МКА
3.2.7. Постановка сэндвич-варианта ТФ ИФА на основе моноклональных антител
3.2.8. Постановка теста ингибиции фокусов флуоресценции
3.2.9. Постановка метода двухфазного ингибирования ТФ ИФА на основе
МКА для определения вируснейтрализующих антител
3.2.10. Определение полноты инактивации, безвредности и реактогенности
3.2.11. Методы статистической обработки результатов и математического моделирования
3.3. Результаты собственных исследований
3.3.1. Модификации метода контроля инактивированных вакцин in vivo
3.3.1.1. Модификация метода NIH с однократной иммунизацией
3.3.1.2. Разработка "периферического" теста

3.3.2. Получение моноклональных антител
3.3.2.1. Иммунизация мышей и контроль иммунного ответа
3.3.2.2. Гибридизация клеток
3.3.2.3. Разработка методов скрининга МКА, специфичных к антигенам вируса бешенства
3.3.2.3.1. Разработка непрямого варианта ТФ ИФА для скрининга МКА
3.3.2.3.2. Разработка иммунопероксидазного монослойного метода для скрининга МКА
3.3.2.3.3. Разработка экспресс-варианта реакции нейтрализации для скрининга
вируснейтрализуюгцих МКА
3.3.2.4. Тестирование специфической антителопродукции гибридных клеток
3.3.2.5. Клонирование гибридных клеток
3.3.2.6. Определение активности МКА в иммунологических реакциях
3.3.2.7. Определение полипептидной специфичности МКА методами имму-
ноблотинга и радиоиммунопреципитации
3.3.2.8. Определение эпитопной специфичности вируснейтрализующих МКА
3.3.3. Получение поликлональных антител
3.3.3.1. Получение и использование иммуноасцитической жидкости, специфической к вирусу бешенства
3.3.3.2. Приготовление антигенсодержащего материала для гипериммунизации
животных
3.3.3.3. Получение антирабической сыворотки лошадей
3.3.3.4. Изучение влияния места и способа введения антигена на формирование
антирабического иммунитета
3.3.3.5. Получение антирабической сыворотки овец
3.3.4. Конъюгирование MICA и ПКА с пероксидазой хрена н контроль активности коньюгатов прямым вариантом ТФ ИФА
3.3.5. Разработка вариантов ТФ ИФА с использованием МКА для контроля инактивированных антирабических вакцин
3.3.6. Разработка прямого варианта ТФ ИФА на основе МКА для обнаружения антигенов вируса бешенства
3.3.6.1. Определение чувствительности и специфичности прямого варианта ТФ

ЬаТоп М. е! а1. (173) проводили сравнительное исследование непрямого и сэндвич-вариантов ТФ ИФА. Соотношение результатов непрямого ТФ ИФА и теста N111 выражены коэффициентом корреляции г=0,88, а сэндвич-варианта ТФ ИФА и теста N111 - г=0,725. В обоих методах использовались МКА, более того, в сэндвич-варианте ТФ ИФА МКА использовались как на подложке, так и качестве конъюгата. Преимуществом проведенных исследований являлось использование МКА, которые выявляли эпитопы, ответственные за нейтрализацию. Несмотря на получение среднего уровня корреляции результатов сэндвич-варианта ТФ ИФА и теста N111, авторы рекомендуют использовать первый для оценки активности анти-рабических вакцин.
Конкурентный вариант ТФ ИФА
Кооуаккег Е.ХМ е! а1. (222,223) проводили определение активности антира-бических вакцин конкурентным вариантом ТФ ИФА с использованием МКА, обладающих специфичностью к основным структурным белкам вируса бешенства: гли-ко - и нуклеопротеину. Сущность постановки реакции заключалась в инкубировании определенного количества МКА, специфичных к глико - или нуклеопротеи-нам, в пластинах с низкой сорбционной емкостью. Проинкубированную смесь переносили в пластину, предварительно сенсибилизированную антигеном. Связавшиеся МКА выявляли антивидовым пероксидазным конъюгатом. Для исследования были использованы вакцины, приготовленные из различных штаммов (ЬЕР,РМ,РУ,8АВ). При использовании антигликопротеидных МКА был достигнут высокий уровень корреляции между результатами конкурентного варианта ТФ ИФА и теста №Н (г=0,95;р<0,01). При использовании антинуклеокапсидных МКА корреляционная зависимость отсутствовала (г= 0; р>0,05). Метод, разработанный на основе антигликопротеидных МКА, рекомендован авторами для контроля анти-рабических вакцин в качестве альтернативы методу N111.
Кроме выбора варианта ТФ ИФА, коррелирующего с тестом КИН, немаловажную роль играет система учета полученных результатов. Так, Иайэп М.еЬ а1. (165) использовали систему учета результатов, при которой за титр исследуемой вакцины, соответствующий активности 2,5 МЕ/см3, принимали разведение, характеризующееся оптической плотностью 0,5.