Диагностика туберкулеза крупного рогатого скота с применением полимеразной цепной реакции

• Автор: Суханов, Игорь Павлович
• Шифр специальности: 16.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 161 с.

СОДЕРЖАНИЕ

Введение
1. Обзор литературы
1.1. Методы диагностики туберкулеза крупного рогатого скота
1.2. Методы прижизненной диагностики
1.2.1. Клинический осмотр
1.2.2. Аллергическое исследование
1.2.3. Серологическое исследование
1.3. Методы послеубойной (посмертной) диагностики туберкулеза крупного рогатого скота.
1.3.1. Патологоанатомическое исследование.
1.3.2. Бактериологическое исследование
1.3.2.1. Микроскопия
1.3.2.2. Культуральное исследование
1.3.2.3. Биологическое исследование (биопроба)
1.4. Полимеразная цепная реакция в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота. з
2. Собственные исследования
2.1. Материалы и методы исследования
2.2. Результаты исследования
2.2.1. Сравнительная оценка тест-систем ПЦР
2.2.2 Определение режима тепловой обработки лабораторной посуды для разрушения ДНК возбудителя туберкулеза
2.2.3.Разработка метода деконтаминации биоматериала от животных
с поверхности от возбудителя туберкулеза и его ДНК
2.2.4.Сравнительная оценка в остром опыте микроскопического,

культурального, биологического, серологического, патологоанатомического методов исследований и ПЦР для диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота
2.2.4.1.Прижизненная диагностика
2.2.4.2.Послеубойная диагностика
2.2.6.Идентификация культур кислотоустойчивых микроорганизмов
3. Обсуждение полученных результатов
4. Выводы
5. Практические предложения
6. Список литературы
7. Приложение

Введение.
Актуальность темы. Туберкулезом из сельскохозяйственных животных наиболее часто поражается крупный рогатый скот. Неблагополучные по туберкулезу хозяйства несут убытки, которые складываются из стоимости погибших от туберкулеза животных и выбракованных туш, пораженных органов, снижения удоев, качества молока, недополучения приплода и молока при преждевременной сдаче на убой выявленных больных коров, а также затрат на проведение противотуберкулезных мероприятий, ограничений хозяйственной деятельности и т.п. Больные животные представляют опасность для здоровья людей (12, 13, 44, 57).
Эта проблема до настоящего время актуальна для многих регионов России, в которой заболеваемость крупного рогатого скота туберкулезом составляет около 2% от имеющегося поголовья (1) и достигает 30% от общей инфекционной патологии у взрослых животных этого вида (27, 68).
В основу противотуберкулезных мероприятий в нашей стране положен комплекс мер, научно разработанных С.Н. Вышелесским совместно с В.Н. Матвеевым, дополненный и усовершенствованный П.П. Вишневским,
М.К. Юсковцом . и др. (138).
В общей системе мер борьбы с туберкулезом наиболее важным звеном является своевременная и достоверная диагностика (133, 163,174). Вместе с тем, имеющиеся на ветеринарном вооружении тесты не в полной мере отвечают предъявляемым к ним, необходимым на сегодняшний день, требованиям. Многие из них весьма трудоемки и не отличаются достоверностью (133, 134, 185).
Основное в профилактике туберкулеза - разрыв контакта с источником инфекции, которым является больное животное. Поэтому своевременное выявление таких животных - главное звено противотуберкулезных мероприятий.

Для амплификации специфического ДНК-фрагмента методом ПЦР достаточно знать нуклеотидную последовательность двух коротких участков, окаймляющих фрагмент - мишень. Это необходимо для синтеза двух олиго-нуклеотидных праймеров - затравок для ДНК-полимеразы. Длина праймеров (обычно 20-30 нуклеотидов) должна быть такова, чтобы их последовательность была статистически уникальна и не встречалась в двух участках ДНК, присутствующей в реакционной смеси.
ПЦР состоит из серии циклов. Каждый из них начинается с шага денатурации (этого достигают нагреванием реакционной смеси до 95 °С), при котором водородные связи между цепями ДНК разрываются и они принимают одноцепочечную форму. Следующий шаг-отжиг праймеров, при этом праймеры соединяются с комплементарными последовательностями, третий шаг -элонгация праймеров в сторону фрагмента мишени под действием ДНК-полимеразы. Такие трехшаговые циклы повторяются много раз (обычно 30-40), пока не образуется достаточное количество продукта ПЦР.
ПЦР дает возможность в течение дня из одной молекулы ДНК получать 100 млрд. сходных по структуре молекул. Эта реакция очень проста в исполнении: нужны лишь пробирка, несколько простых реагентов и источник тепла. Препарат ДНК, который необходимо копировать, может быть чистым, а может представлять собой очень сложную смесь биологических веществ. В качестве источника ДНК подходит и биоптат ткани пациента, и одиночный человеческий волос, и капля засохшей крови, и мозг мумии и даже тело мамонта, пролежавшего 40000 лет в вечной мерзлоте (120).
Современными характеристиками ПЦР в лабораторной диагностике инфекций является её быстрота, непревзойденная чувствительность и высокая специфичность, что позволяет надежно и к тому же количественно обнаруживать микроорганизмы, присутствующие в очень низких концентрациях (1-10 клеток возбудителя в пробе). При этом ДНК или РНК инфекционных