Иммунобиологические свойства рекомбинантных аденовирусных наночастиц как универсальной технологической платформы для создания противогриппозных вакцин

• Автор: Шмаров, Максим Михайлович
• Шифр специальности: 14.03.09
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 242 с. : 48 ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Вакцинопрофилактика гриппа
1.2 Генетическая иммунизация
1.3 Общая характеристика рекомбинантных вирусных наноструктур и перспективы их использования в медицине
1.4 Генетические вакцины на основе РВН
1.5 Структурная организация и способы создания рекомбинантных аденовирусных наноструктур
1.6 Способы повышения эффективности генетических вакцин
2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Материалы
2.2 Методы
2.3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.3.2 Экспрессия генов НА вируса гриппа конструкциями РАВН-Ад5-НА5-2, РАВН-Ад5-НА 1 -1, РАВН-Ад5-НАЗ-2, РАВН-Ад5-НАВ in vitro
2.3.3 Иммуногенные свойства созданных конструкций РАВН-Ад5 со вставками генов НА вирусов гриппа in vivo и выбор эффективного способа их введения в организм
2.3.5 Иммуногенность рекомбинантных НА вирусов гриппа экспрессируемых РАВН-Ад5-НА1-1, РАВН- Ад5-НАЗ-2 и РАВН- Ад5-НАВ
2.3.6 Оценка клеточного иммунного ответа у лабораторных животных, интраназально иммунизированных аденовирусом РАВН-Ад5-НА5
2.3.7 Перекрестный иммунный ответ при интраназальной иммунизации лабораторных животных РАВН, экспрессирующими ген НА вируса гриппа А
2.3.8 Особенности гетеросубтипического иммунного ответа при введении РАВН-Ад5, экспрессирующих НА вируса гриппа А субтипа H5N2

2.3.9 Иммуногенные свойства консервативных антигенов вируса гриппа А и попытка создания вакцин широкого спектра действия, защищающих от
2.3.10 Определение способности молекулярного адъюванта - кислого пептидогликана - взаимодействовать с Толл-подобными рецепторами врожденного иммунитета in vitro и усиливать иммуногенность РАВН-Ад5139
2.3.11 Технология получения вакцины на основе РАВН-Ад5 с помощью биореакторов волнового типа: условия культивирования клеток НЕК293, инфекция клеток РАВН-Ад5 и хроматографическая очистка РАВН-Ад5
2.3.12 Разработка методов контроля качества препаратов РАВН-Ад5
2.3.13 Доклинические исследования безопасности кандидата ой вакцины против птичьего гриппа на основе РАВН-Ад5-НА
2.3.14 Доклинические исследования эффективности и безопасности кандидатной трехвалентной противогриппозной вакцины на основе РАВН-Ад5, экспрессирующих НА вируса гриппа A H1N1, H3N2 и вируса гриппа В
вирусов гриппа А различных субтипов,

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ Ад5 - аденовирус человека пятого серотипа БАЛ - бронхо-альвеолярный лаваж БОЕ - бляшкообразующая единица БСА — бычий сывороточный альбумин ВА-РНК - вирус-ассоциированная РНК ВИЧ - вирус иммунодефицита человека ВОЗ - Всемирная Организация Здравоохранения ГАЕ - гемагглютинирующие единицы ГПМА - Лг-(2-гидроксипропил)-метакриламид ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ДСН - додецил сульфат натрия дНТФ — дезоксинуклеотидтрифосфат ЕТГА - единицы торможения гемагглютинации ИКП - инвертированный концевой повтор ИФА - иммуноферментный анализ ИФН - интерферон КРС - крупный рогатый скот ЛД - летальная доза мРНК - матричная РНК ОТ - обратная транскрипция п.н. - пар нуклеотидов ПСА - простато специфический антиген ПЦР - полимеразная цепная реакция ПЭГ - полиэтиленгликоль
РАВН - рекомбинантные аденовирусные наноструктуры
РВН - реакция вирус-нейтрализации
РВН - рекомбинантные вирусные наноструктуры
РГА - реакция гемагглютинации
РНК - рибонуклеиновая кислота

хозяевам дефектным. Поэтому он может служить основой для безопасной вакцины для различных домашних и селькохозяйственных животных (млекопитающих). Исследования роли каждого из двух фиберов вируса CELO при взаимодействии с клетками показали, что вирус CELO использует в клетках млекопитающих тот же рецептор, что и Ад5 (CAR). Возможно, модификация или замена длинного фибера CELO позволит получать РАВН-CELO с измененной тропностью и повышенной эффективностью трансдукции [206].
Следует отметить, что при получении традиционных вакцин против гриппа основными антигенами всегда считались НА и нейраминидаза [203], так как они являются поверхностными и высокоиммунногенными белками, а НА вызывает индукцию вируснейтрализующих антител, что позволяет остановить гриппозную инфекцию на ранних стадиях. Однако НА и нейраминидаза имеют существенный недостаток - это белки с нестабильной антигенной структурой, варьирующей от штамма к штамму. Таким образом, вакцины, основанные на одном из поверхностных антигенов вируса гриппа, характеризуются узкой специфичностью действия. Поэтому применение различных консервативных антигенов вируса гриппа для создания генетических вакцин так же является перспективным. Такими антигенами могут быть Ml и М2 белки вируса гриппа А [71, 72], нуклеопротеин NP вируса гриппа А [93], и даже полимеразный белок РВ2 [65]. Так как изменчивость этих белков от штамма к штамму значительно ниже, чем у гликопротеинов вируса гриппа, возможно создание на их основе вакцин широкого спектра действия, защищающих не только от дрейфовых, но и от шифтовых вариантов вируса гриппа А.
1.5 Структурная организация и способы создания рекомбинантных аденовирусных наноструктур
Вирионы аденовирусов состоят из двухцепочечной молекулы ДНК, окруженной белковой оболочкой (капсидом) (рис. 1). Вирионы