Изучение особенностей поликлонального иммуноглобулина Е человека и ассоциированных с ним молекул для повышения эффективности диагностики аллергии in vitro

• Автор: Сергеева, Анна Юрьевна
• Шифр специальности: 14.00.36
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 158 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Поликлональные Е и аутоанти- 1§Е антитела человека. Роль в патогенезесе и диагностике аллергических заболеваний
1.1. 1§Е - зависимые механизмы возникновения и развития аллергических реакций
1.2. Т-клетки и цитокины в регуляции синтеза 1аЕ. Поиски генов аллергии
1.3. Особенности структуры молекулы 1§Е
1.4.Прогностическое значение неонатального определения 1§Е. Исследования влияния различных факторов на уровень 1§Е в пуповинной крови
1.5. Роль аутоанти 1§Е антител в регуляции и определении Е
при атопических заболеваниях
1.5.1. Литературные данные о трехмерной структуре комплекса идеотип-анти-идеотип
1.5.2. Изучение роли аутоанти Е антител т ntro
1.5.3. Значение анти-1§Е аутоантитела при атопических заболеваниях
1.5.4. Корреляция между уровнями общего 1§Е , анти-Е и Г«Е в комплексе с аутоантителами по данным различных групп исследователей. Влияние анти-Е аутоантител на
диагностическое определение 1§Е
1.5.5. Возможное влияние других факторов на диагностическое определение Е
1.6. Специфическая иммунотерапия и перспективы ее использования
1.7. Роль анти-1§Е аутоантител при СИТ
1.8. Моноклональная анти - 1§Е -плазмоиммуносорбция в комплексном лечении больных атопической бронхиальной астмой
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Материалы
2.2. Методы
2.2.1. Выделение моноклональных антител из асцитной жидкости
2.2.2. Измерение концентрации белка в препаратах
2.2.2.1. Определение белка по Брэдфорду
2.2.2.2. Определение белка по оптической плотности
при 280 нм
2.2.2.3. Определение концентрации белка по Лоури
2.2.3. Приготовление конъюгатов моноклональных антител
к 1§Е с пероксидазой хрена
2.2.4. Аффинная хроматография иммуноглобулина Е
2.2.4.1. Приготовление аффинного сорбента с моноклональными анти- 1Е антителами
2.2.4.2. Аффинная очистка белка
2.2.4.3. Экстракорпоральная анти- Е - специфическая плазмоиммунос орбция
2.2.4.4. Выделение элюатов после плазмоиммуносорбции
2.2.5. Электрофорез образцов элюатов в ПААГ
2.2.6. Иммуноблоттинг образцов элюатов
2.2.7. Иммуноферментный анализ для определения концентрации Е (общая схема)
2.2.8. Иммуноферментное определение комплексов I££-!§(}
2.2.8.1. Иммуноферментный анализ на нитроцеллюлозе
2.2.8.2.Иммуноферментный анализ на микротитрационных планшетах
2.2.9. Иммуноферментный анализ для определения специфического иммуноглобулина Е
2.2.9.1. Нанесение аллергенов на нитроцеллюлозную
основу

2.2.9.2. Приготовление стрипов
2.2.9.3. Проведение иммуноферментной реакции
2.2.9.4. Приготовление проявляющих растворов
2.2.9.5. Оценка результатов
2.2.10. Определение специфического 1Е с помощью набора Иммунодот
2.2.11. Обработка результатов и графическое оформление
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1.Разработка иммуноферментного метода определения
уровня неонатального и пуповинного Е человека
3.1.1.Разработка гиперчувствительной ИФА тест системы на основе моноклональных антител для определения общего
1яЕ в пуповинной крови и сыворотках новорожденных
3.1.2. Выбор пары антител и твердой фазы
3.1.3. Оптимизация приготовления конъюгата
3.1.4. Выбор условий проведения анализа
3.1.4.1 Подбор оптимальной продолжительности
стадий анализа
3.1.4.2. Подбор проявляющего субстрата
3.1.4.3.Подбор оптимальной концентрации нижних антител
3.1.4.4. Подбор оптимального разведения периферической или пуповинной сыворотки
3.1.5. Основные параметры тест-системы
3.1.6. Результаты лабораторных испытаний тест-системы
3.1.7. Определение концентрации Е в клинических образцах. Анализ сывороток пуповинной крови матерей, инфицированных герпесом
3.1.8.Общие выводы
3.2. Биохимический анализ эллюатов с 1Е специфических плазмоферезисных колонок
3.2.1. Выбор стратегии иммуносорбции и приготовление

аутоантителам, могут мимикрировать отдельные структуры антигенов (аллергенов), и, связываясь антиген-подобными сайтами с молекулой IgE, приводить к высвобождению гистамина тучными клетками и базофилами. Эта анафилактогенная способность анти-IgE аутоантител подтверждена многочисленными исследованиями, рассмотренными ниже.
1.5.2.Изучение роли аутоанти IgE антител in vitro
Изучение основного объекта аллергических исследований -молекулы IgE - показало, что помимо цитокинов, таких как интерлейкин-4 и гамма-интерферон, анти-IgE аутоантитела могут участвовать в регуляции синтеза IgE. В частности, было продемонстрировано, что анти-IgE аутоантитела ингибируют синтез IgE in vitro (Stadler BM; 1991), и, что комплексы IgE и анти-IgE аутоантител могут супрессировать продукцию IgE миеломной В-клеточной линией U266 (Nakajima, 1989). Спонтанная продукция IgE в культурах, произведенных из мононуклеарных клеток больных, сесибилизированных к пыльце и домашней пыли, также ингибировалась моноклональными анти- IgE антителами. Позднее De Weck и авторы (Vasselia, 1991), предположив, что эти исследования могут быть неточными из-за влияния анти- IgE антител на измерение уровня IgE, которое проводится на основе ксеногенных анти- IgE антител, исследовали влияние анти- IgE антител на синтез IgE, измеряя уровни IgE мРНК. Эти же авторы показали, что моноклональные анти-IgE антитела, а также анти-IgE аутоантитела являются потенциальными активаторами Т-клеточной пролиферации. Такие активированые Т-клетки могут, продуцируя цитокины, например IL-4 и у-интерферон, влиять на синтез IgE.
Кроме того, было показано, что анти-IgE аутоантитела ингибируют связывание молекулы IgE с низкоаффинным IgE-рецептором Fcs RII (CD23) или удаляют уже связавшийся IgE с поверхности FcsRII-положительных клеток (Chretien I., 1988; Stadler BM; 1991).