Иммуноферментный анализ антител к пептидным биорегуляторам и белкам системы гемостаза в норме и при патологии

• Автор: Савицкая, Юлия Анатольевна
• Шифр специальности: 14.00.36
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 93 с.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
«БИОРЕГУЛЯТОРЫ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА»
1.1. Белковые факторы регуляции системы гемостаза
1.1.1. Общая характеристика тромбина и его природных ингибиторов
1.1.2. Биологическая функция тромбина и его природных ингибиторов при развитии патологии 14
1.1.3. Методы определения тромбина, его природных ингибиторов и их использование в
диагностике заболеваний
1.2. Пептиды ренин-ангиотензиновой и калликреин-кининовой систем 20
1.2.1. Структура и физиологическая роль ангиотензина II и брадикинина
1.2.2. Значение пептидов ренин-ангиотензиновой и калликреин-кининовой систем в норме и
при развитии ряда заболеваний
1.2.3. Методы определения пептидов: ангиотензина II и брадикинина, и возможность их
применения в медицинской диагностике
1.3. Взаимосвязь биорегуляторов системы гемостаза
1.3.1. Ренин-ангиотензиновая и калликреин-кининовая системы
1.3.2. Факторы системы свёртывания крови и пептидные биорегуляторы
1.4. Роль гуморального иммунитета в регуляции системы гомеостаза при
патологии
1.4.1. Естественные антитела к физиологически активным соединениям и их биологическая
Функция
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы исследования
2.2. Методы исследований
2.3. Получение конъюгатов гаптенов на полимерном носителе
2.3.1. Получение конъюгата ангиотензина II
2.3.2. Получение конъюгата брадикинина
2.4. Выделение сывороточных белков из плазмы крови
24 1 Выделение антитромбина III из плазмы крови
2.4.2. Иммунохимический анализ чистоты антитромбина III
2.4.3. Выделение сь-макроглобулина из сыворотки крови
2.5. Получение иммуноспецифических реагентов для метода латексной
агглютинации
2.5.1. Получение моноспецифической антисыворотки к антитромбину III
2.5.2. Синтез конъюгата на основе СМК-латекса
2.5.3. Метод латексной агглютинации

2.6. Разработка метода ИФА выявления естественных антител к белкам и гаптенам
2.6.1. Определение рабочего разведения сыворотки и концентрации антигена
2.6.2. ИФА белков и пептидов в сыворотке крови человека
2.7. Выделение антител к брадикинину и ангиотензину II из сыворотки крови человека
2.7.1. Получение сорбента для аффинной хроматографии
2.7.2. Выделение антител к брадикинину и ангиотензину II аффинной хроматографией
2.8. Определение специфичности и аффинности выделенных на аффинном сорбенте антител к брадикинину и ангиотензину Д
2.8.1. Выбор условий проведения ингибиторного ИФА
2.8.2. Ингибиторный ИФА для оценки специфичности и аффинности антител к брадикинину и ангиотензину II
2.8.3. Определение специфичности антител к брадикинину и ангиотензину II
2.8.4. Расчёт константы аффинности антител
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Получение реагентов для проведения ИФА определения антител к белкам и
пептидным биорегуляторам
3.1.1. Синтез конъюгированных антигенов пептидов на полимерной матрице
3.1.2. Выделение белковых факторов системы гемостаза: антитромбина III и а2-макроглобулина

3.1.3. Получение конъюгата для определения антитромбина III методом латексной агглютинации
3.2. Разработка ИФА определения антител к пептидным биорегуляторам системы гемостаза
3.2.1. Определение уровня антител к ангиотензину II и брадикинину в сыворотке крови доноров и больных
3.2.2. Определение уровня антител к ангиотензину II в сыворотке крови больных
3.2.3. Определение уровня антител к брадикинину в сыворотке крови больных
3.2.4. Исследование иммунохимических свойств естественных антител к пептидным биорегуляторам системы гемостаза
3.2.5. Практическая значимость выявления антител к пептидным биорегуляторам системы гемостаза
3.3. ИФА определения антител к белковым факторам системы гемостаза и его применение в клинике
3.3.1. Определение методом ИФА антител к антитромбину III
3.3.2. Практической значимость выявления антител к антитромбину III
3.3.3. Определение антител методом ИФА к тромбину и его природным ингибиторам
3.3.4. Установление взаимосвязи между уровнем антител к белковым факторам системы гемостаза и биохимическими показателями этой системы
3.3.5. Влияние терапии на показатели системы гемостаза и гуморального иммунитета у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями и нарушением обмена веществ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы.
Исследования последних лет направлены на разработку новых методов иммунохимического анализа низкомолекулярных пептидных биорегуляторов и белков, играющих важную роль в патогенезе ряда заболеваний заболеваний.
Хорошо известно, что изменения гемостаза, связанные с функционированием его основных звеньев - белковых факторов системы свёртывания крови человека: тромбина и его ингибиторов (антитромбина III и а.2-макроглобулина), а также пептидных биорегуляторов калликреин-кининовой и ренин-ангиотензиновой систем, имеют большое значение в патогенезе атеросклероза, ишемической болезни сердца, гипертонии, нарушении обмена веществ.
В основе сердечно-сосудистых катастроф (острый инфаркт миокарда, инсульт) лежит, как правило, тромбоз, обусловленный активацией тромбоцитов и процессов свёртывания крови.
Вот почему актуальна задача создания надёжных диагностических методов контроля, позволяющих следить за состоянием организма человека, которые можно использовать в норме и при проявлении патологических симптомов.
В нашей стране и за рубежом используются традиционные подходы для создания диагностических тест-систем, которые заключаются в разработке способов количественного определения белковых либо пептидных факторов, участвующих в механизме развития заболевания.
Однако из литературных данных, известно насколько длительно создание надёжного и простого иммунохимического метода анализа перечисленных выше соединений. Это, в первую очередь, связанно с трудоёмкостью разработки специфического анализа и высокой чувствительностью, так как эти вещества в активном состоянии существуют в организме человека в небольших концентрациях и быстро метаболизируются, что затрудняет их выявление в сыворотке крови.
С другой стороны, в настоящее время выполнены исследования, свидетельствующие о наличии в организме здорового человека иммуноглобулинов, взаимодействующих с рядом эндогенных биорегуляторов и называемых естественными антителами.

Далее тестировали новый состав (Ное,140 D-AII, [Hyp3, D-Tic7, Oic8|-BK) Ное140 вызывает сильное блокирование сосудопрессорного действия, реагируя на ввод БК, но не эффективен в отношении системной или почечной гемодинамики у контрольных или диабетических крыс.
Во втором случае, контрольные и диабетические крысы были обработаны рамприлом в течение 1-2 недель, затем изучали функцию почек до и после введения раствора Ное140 (0.1 мг). Ингибиторы АПФ понижают АД в обеих группах. Ное140 не влияет на функцию почек у контрольных крыс, но у диабетических крыс, обработанных рамприлом, стимулирует умеренное, но в тоже время значительное падение гломеральной фильтрации крыс.
Рамприл вызывает предсказываемые изменения в системной и внутри почечной РАС и для него также характерен неустойчивый эффект параметров РАС. Проведённые исследования предполагают, что эндогенная ККС играет только второстепенную роль в стимуляции почечной гемодинамики у диабетических крыс, в отсутствие стимуляции ККС ингибиторами АПФ.
Однако АПФ - это также киназа II, которая служит для увеличения активности эндогенного кинина Увеличение кининовой активности является результатом обработки ингибиторами АПФ и в меньшей степени может участвовать в гемодинамической регуляции диабета.
Carey R.M., Siragy НМ, Jaffa А.А. пришли к выводу, что РАС является модулятором образования почечного БК [53]. Показано, что недостаток Na в организме связан с увеличением активности почечной ККС. ККС может играть важную роль в дисбалансе почечных эффектов РАС. Почечная РАС участвует в регуляции почечным БК степени недостатка Na.
На рисунке 4 показана схема РАС и её взаимосвязь с ККС [13].
Приведённые данные указывают на важную роль РАС и ККС систем крови в процессах регуляции гемодинамики и позволяют предполагать их участие в формировании гемодинамических сдвигов, свойственных сердечно-сосудистой системе, определяется, по-видимому, не столько абсолютным уровнем прессорных и депрессорных субстанций в крови, сколько их соотношением и характером взаимосвязи между ними [124,127].