Экспрессия белков области pX вируса Т-клеточного лейкоза человека I типа в клетках Escherichia coli и перспективы использования рекомбинантных белков в диагностике

• Автор: Сусова, Ольга Юрьевна
• Шифр специальности: 14.00.14
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 129 с.

СОДЕРЖАНИЕ
Перечень условных сокращений
Введение
глава I. Обзор литературы
1. Эпидемиология HTLV-I и ассоциация с заболеваниями человека
1.1. Злокачественная Т-клеточная лимфома взрослых (ATL)
1.2. Тропический спастический парапарез (TSP)
1.3. Другие заболевания, ассоциированные с HTLV-I
2. Молекулярно-биологическая характеристика HTLV
2.1. Белки HTLV
2.2. Структура LTR
3. Регуляция генной экспрессии и репликации HTLV-I
3.1. Трансактивирующие свойства Tax
3.2. Tax и апоптоз
3.3. Rex-белок как негативный регулятор вирусной генной экспрессии
4. Диагностическая значимость антител к Tax- и Rex-белкам
ГЛАВА II. Материалы и методы.
Раздел 1. Материалы
Раздел 2. Методы
ГЛАВА III. Результаты собственных исследований
Раздел 1. Молекулярное клонирование и экспрессия продуктов гена гех в клетках Е. coli. Клон рСО
1.1. Клонирование фрагмента гена rex HTLV-I в вектор рАТН. КлонрСО
1.2. Клонирование фрагмента гена rex HTLV-I в вектор рЕХ. Клон рСО
1.3. Выделение рекомбинантного Rex HTLV-I и использование его для иммунизации кроликов
1.4. Тестирование продуктов гена rex HTLV-I в клеточных линиях методом иммуноблоттинга
Раздел 2. Молекулярное клонирование и экспрессия продуктов гена tax HTLV-I в клетках Е
2.1. Клонирование N-терминальной области гена tax HTLV-I в векторах
рАТН и pMAL-c: клоны рСО-3-5, рСО-8-1 и рСО
2.2. Клонирование С-терминальной области гена tax .HTLV-I в векторах рАТН и pMAL. Клоны рСО-5-1 и рСО
2.3. Клонирование почти полноразмерного гена tax HTLV-I в векторных системах рАТН, pMAL-с и pMAL-p. Клоны рСО-12-20, рСО-13-8-с и рСО-13-4-р
2.4. Клонирование С-терминальной области гена tax HTLV-I в вектор pMAL-c: получение клона рСО
2.5. Получение иммунной кроличьей сыворотки к рекомбинантному белку клона рСО
2.6. Попытки протеолитического разделения рекомбинантного белка
рСО-15-3 фактором Ха. Получение клона pCO-15-3cRI
ГЛАВА IV. Обсуждение
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Приложение 1

ЛИСТ УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
HTLV-I, HTLV-II - вирусы Т-клеточного лейкоза человека I и II типов
HIV - вирус иммунодефицита человека
BLV - вирус бычьего лейкоза
STLV - вирус Т-клеточного лейкоза обезьян
ATL - Т-клеточный лейкоз взрослых, ассоциированный с HTLV-I
TSP - Тропический спастический парапарез
ПЦР - полимеразная цепная реакция
IL-2 - интерлейкин
IL-2R - рецептор интерлейкина
LTR - длинный концевой повтор
РБ - рекомбинантный белок
М.м. - молекулярная масса
кДа - килодальтон
NF-kB - ядерный фактор транскрипции
ORF - открытая рамка считывания
PBS - фосфатно-солевой буфер
TNF-a - фактор некроза опухолей альфа
ДСН - додецилсульфат натрия
сАМР - циклический аденозинмонофосфат
МСБ - мальтозосвязывающий белок
п.н. - пар нуклеотидов
ам.к. - аминокислот
E.coli - Escherichia coli
tax, rex и т.д
Tax, Rex и т.д. - белки
Rex, RxRE играет важную роль в 3’-процессинге первичного транскрипта вируса. Как упоминалось выше, -область LTR HTLV-I является необычайно длинной в сравнении с другими ретровирусами, в результате чего сигнал полиаденилирования вируса отделен от 3’-сайта нарезания последовательностью RxRE. Эта дистанция не позволяет процессировать 3 ’-конец первичных транскриптов вируса.
Рис. 7. Последовательность нуклеотидов и вторичная структура RxRE HTLV-
I. Выделенная область - последовательность, необходимая для взаимодействия с Rex HTLV-I [60].
Было показано, что шпилечная структура RxRE помещена между гексамером AAUAAA и GU-богатым элементом, которые важны для полиаденилирования, и два ядерных фактора связываются с этой вторичной структурой, способствуя РНК-полиаденилированию. Образование уникальной правильной (корректной) вторичной структуры RxRE дает возможность поли(А)-сигналу встать на необходимом расстоя-
HTLV-I RxRE
С G U G G С и С

AAUUUUGGCACGCAUAUGGCUCAMJAXAOJAUJGCUCUCUACGIXXXJUGUULIOGIJLIUOCUGUUCUGCGCCGUU
Poly А signal
f GU-rich Poty A site element