Биологический потенциал мутантных вариантов генов Е6 и Е7 вируса папиллом человека тип 18

• Автор: Лаасри Мажид
• Шифр специальности: 14.00.14
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 118 с. : ил.

Оглавление
СТ'р
Глава I. Введение
Глава 2. Обзор литературы: Вирусы папилломы человека как модель
изучения молекулярных механизмов канцерогенеза.
2.1. Генетическая структура вирусов папиллом и ид роль в канцерогенезе 9 V чшюв&кв
2.2 Регуляция транскрипции вирусных генов
2.3.Трансформирующие гены вирусов папиллом
> 5 1 Г-Л., Т5Й 1 О
-1 1 г А ЬП *
2.3.2. Ген Е7
2.4, Функциональная кооперация онкобелков Еб и Е7
Глава 3. Материалы и методы
3.1, Список использованных растворов и сред
3,2-Мояекулярное клонирование
3.2 Л -Ферменты
3.2.2 Бактериальные штаммы и плазмиды
3,2.3-Трансформация бактерий Е.еоН. плазмидной ДНК
а). Получение компетентных клеток
бф Введение в клетки плазмидной ДНЕ
3.2.4. Выделение ппазмидной ДНК
3.2.5. Рестрикция и лигирование
3.2.6. Синтез олигодезоксирибонуклеотндов
3.2.7. Секвенирование
3.2.8. Электрофоретическое разделение продуктов ееквенирования в денатурирующем полк а кр ялам и дн о м геле (ПААГ)
3.2.9. Амплификация ДНК
3.2.10. Клонирование генов Е6 и Е7 НРУ18
3.2.11. Сайт-направленный мутагенез
3.3. Получение и анализ культур клеток млекопитающих
3.3.1. Плазмиды и векторы
3.3.2. Клеточные линии
3.3,3 Трансфекция клеток млекопитающих
3.3.4. Выделение РНК и ДНК с. помощью гуанидин изотиоцианата
3.3.5. Препаративное выделение специфических фрагментов ДНК из агарозных гелей
3.3.6. Препаративный электрофорез ДНК в агарозных гелях.
3.3.7. Г ибридизация
3.3.7.1. Перенос ДНК из геля на нейлоновый фильтр (НуЬопс! М+ )
3.3.7.2. Получение молекулярных ДНК-зондов
3.3.7.3. Гнбридизация ДНК, иммобилизованной на фильтрах
3.3.7.4. Авторадиография
3.3.7.5. Пробы дли гибридизации
3.3.8. КТ-РСК
3.3.9, Биологические свойства
3.3.9.1, Рост кдо но в
3.3.9.2. Измерение времени удвоения и насыщения плотности клеточной популяции
3.3,93. Культивирование клеток в полужидкой среде
53.9.4. Введение клеток в сингенны крыс (линия Фишер)
Глава 4. Результаты исследовании
4.1. Введение
4.2. Молекулярное клонирование
4.2.1. Анализ последовательностей вставки в плазмиде рС7
4.2.2. Субкзгоннрование генов Б6 и Б7
а). Ген Еб
б). Ген Е7
4.2.3. Получение и клонирование новых мутантных вариантов гена Е7 ВРУ тип 18,
4.3. Исследование биологической активности клонированных генов 43Л,Трансфекция чувствительных клеток
3.2,3. Трансформащга бактерий Е.соІЇ. плазящщной ДНК а). Получение компетентных клеток
Бактерии штамма С600 геоА переносились в 5 мл среди 1,В я инкубировались ночь при 37 °С. Затем 100 мкл ночной культуры добавлялись к 10 мл среды. Клетки выращивалась при 37 °С с хорошей аэрацией в течение нескольких часов до достижения оптической плотности 0.4 (при дайне волны 550 нм), что соответствует концентрации 5x107 клеток на. 3 мл среды. Бактерии осаждались центрифугированием (центрифуга К-23, 4000 об./мин, 20 мин, 4 °С), ресуспендировались в 5 мл охлажденного стерильного раствора, содержащего ОЛмМ СаСЬ и 10 мМ ірис- НСІ (pH 8,0), затем инкубировались в ледяной бане 1 час, и вновь осаждались в тех же условиях. Клетки ресуепендировалнсь в I мл ледяного стерильного раствора того же состава, В целях повышения эффективности трансформации, клетки инкубировались в течение ночи при 4°С.
I), Введение в клетки шіатшідной ДНК
К 0,2 мл бактериальной суспензии добавляли 30-50 нг плазмидной ДНК, и инкубировали 30 мин при 0 °С. затем бактерии подвергались тепловому шоку (42 “С, 2 мин.), и вновь инкубировались 10 мин. при 0 °С. После добавления І мл среды КВ инкубацию продолжали еще 1 час при 37°С. 0,2-0,5 мл бактериальной суспензии переносили на поверхность 1.5 % агара, залитого на чашки Петри, содержащего ампициллин (50 мг/мд). Чашки