Генетико-биохимическая гетерогенность рибонуклеаз злаковых культур в связи с разработкой новых методов отбора в селекционном процессе

• Автор: Новиков, Борис Николаевич
• Шифр специальности: 06.01.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Краснодар
• Количество страниц: 142 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Классификация нуклеаз растений
1.1.1. Биохимическая классификация
1.1.2. Сходство аминокислотных последовательностей рибонуклеаз
1.2. Локализация РНК-деградирующих ферментов в растении
1.2.1. РНКазы клеточных ядер
1.2.2. Цитоплазматические РНКазы
1.2.3. РНКазы, связанные с рибосомами и микросомами
1.2.4. РНКазы митохондрий и хлоропластов
1.2.5. Секретируемые РНКазы
1.3. Модуляция активности рибонуклеаз факторами окружающей среды
1.3.1. Засоление и обезвоживание
1.3.2. Температурный стресс
1.3.3. Поранение и болезни
1.4. Изменения уровня активности и изоферментного состава РНКаз в онтогенезе растений
1.5. Регуляция активности рибонуклеаз в растении
1.5.1. Регуляция активности на уровне транскрипции и трансляции
1.5.2. Взаимодействие с эффекторными молекулами и постгрансляционная модификация
1.6. РИБОНУКЛЕАЗЫ В ДЕГРАДАЦИИ МРНК
1.6.1. Удаление кэп-структуры на 5'-конце мРНК
1.6.2. Экзорибонуклеазы
1.6.3. Эндонуклеазы
1.6.4. Деаденилирование мРНК
1.6.5. РНКазы, связанные с мРНК
1.7. Заключение по обзору литературы
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Подготовка растительного материала
2.2. Экстракция белков

2.3. Определение концентрации белка
2.4. Определение РНКазной активности в гомогенатах тканей
2.5. Определение активности РНКаз в хроматографических фракциях
2.6. Оценка изоферментного спектра рибонуклеаз методом изоэлектрофокусирования
2.7. Оценка изоферментного спектра рибонуклеаз методом ПОЛУДЕНАТУРИРУЮЩЕГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
2.8. Выделение и определение характера действия РНКазы с рі 4
2.9. Выделение полирибосом
2.10. Экстракция рибонуклеаз, ассоциированных с полирибосомами
2.11. Выделение суммарной РНК
2.12. Аффинная хроматография на поли(У)-сефарозе
2.13. Термальная хроматография
2.14. Радиоактивное мечение зондов полинук леоти дкиназой фага Т4
2.15. Гибридизация радиоактивно меченых олигонуклеотидных зондов с поли(А)мРНК на колонке поли(У)-сефарозы
2.16. Дот-блот гибридизация суммарной РНК НА ФИЛЬТРАХ
2.17. Обработка РНК целитом
2.18. Электрофоретический анализ РНК
2.19. Статистическая обработка результатов
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Изучение изоферментного состава РНК-деградирующих ферментов
3.1.1. Цитоплазматические нуклеазы ячменя
3.1.2. Цитоплазматические нуклеазы пшеницы
3.1.3. РНК-деградирующие ферменты хлоропластов, митохондрий и межклеточной жидкости ячменя и пшеницы
3.1.4. Цитоплазматические нуклеазы созревающего зерна кукурузы
3.1.5. Изучение межсортового и межвидового полиморфизма РНКаз
3.2. РНК - деградирующие ферменты, ассоциированные с полирибосомами и мРНК пшеницы и ячменя
3.2.1. РНКазы, ассоциированные с полирибосомами пшеницы и ячменя
3.2.2. РНКазы, связанные с РНК
3.2.2.1. Деградация РНК в высокоочищенных препаратах
3.2.2.2. Влияние катионов на эффективность распада мРНК в системе in vitro
3.2.2.3. Влияние циклогексимида на распад мРНК в системе in vitro
3.3. Влияние экзогенных факторов на РНКазную активность
3.3.1. Изменение общего уровня РНКазной активности в стрессовых условиях
3.3.2. Динамика изменения активности РНКаз в условиях абиотических стрессов
3.3.3. Изменение в условиях стресса изоферментного состава РНКаз
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
5. ВЫВОДЫ
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ците исключительно на уровне активизации трансляции мРНК [Ong,1980]. Эти результаты говорят о том, что наблюдаемое при различных стрессах неспецифическое увеличение РНКазной активности может обеспечиваться различными типами регуляторных систем.
Использование радиоактивно меченых зондов, комплементарных нуклеотидным последовательностям генов РНКаз, позволило контролировать динамику накопления и распада мРНК индивидуальных ферментов при изменении условий окружающей среды. Так было показано накопление транс-криптов генов секретируемой (RNase LE) и внутриклеточной (RNase LX) РНКаз в культуре клеток томатов, индуцированное недостатком фосфора в культуральной среде [Kock et.al., 1995]. К сожалению, не было представлено данных об изменении стабильности мРНК. Поэтому остается неясным обеспечивался ли наблюдаемый эффект только за счет усиления транскрипции, и не может ли стабилизация мРНК этих ферментов выполнять регуляторную функцию.
Неясно также могут ли растительные РНКазы контролировать время жизни собственной мРНК. Для бактериальных систем случаи саморегуляции активности нуклеаз уже описаны как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции и стабильности мРНК. Эндонуклеаза рестрикции Taql специфически может связываться с транскриптом собственного гена и ингибировать трансляцию. При удалении из Taql мРНК шпильки, в стебле которой содержится последовательность, соответствующая сайту узнавания на ДНК, сильно стимулируется экспрессия эндонуклеазы. Опероны некоторых ферментов системы модификации-рестрикции, кодируют пептиды, (PvuII, Smal, EcoRV и BamHI - с-пептид, PvuII - w-пептид), которые служат ингибиторами продуктов их же транскрипции-трансляции [Матвиенко и др.,1997].
Также показано, что РНКаза Е, которая является ключевым ферментом, деградации мРНК в E.coli, регулирует свой синтез посредством изменения скорости деградации своего собственного транскрипта. В зависимости от