Исследование онтогенетической и тканеспецифической экспрессии гена Grp, геномного гомолога гена gag ретротранспозона gypsy, у Drosophila melanogaster

• Автор: Кузьмин, Илья Владимирович
• Шифр специальности: 03.03.05, 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 101 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ
1. МОБИЛЬНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭЛЕМЕНТЫ И ИММУНИТЕТ У ДРОЗОФИЛЫ (обзор литературы)
1.1 Мобильные генетические элементы
1.1.1 Классификация мобильных генетических элементов
1.1.2 Строение и жизненный цикл ретровирусов
1.1.3 Особенности ДКП-ретротранспозонов и их сходство с ретровирусами
1.1.4 Взаимодействие ретротранспозонов и ретровирусов
1.1.5 Потенциальные эффекты транспозиции мобильных элементов
1.1.6 Онтогенетическая регуляция экспрессии мобильных элементов и участие мобильных элементов в эмбриональном развитии
1.2 Иммунитет у дрозофилы
1.2.1 Врожденный иммунитет у дрозофилы
1.2.2 Участие РНК-интерференции в противовирусной защите
1.2.3 Контроль перемещения ретроэлементов как способ противовирусной защиты
1.2.4 Другие механизмы противовирусной защиты
1.3 Молекулярная доместикация последовательностей мобильных элементов
1.3.1 Что такое молекулярная доместикация
1.3.2 Различные случаи молекулярной доместикации
1.3.3 Доместикация гена gag ДКП-ретротранспозонов
1.3.4 Grp - геномный гомолог гена gag у дрозофилы

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Материалы
2.1.1 Объект исследования
2.1.2 Штаммы Escherichia coli
2.1.3 Праймеры для ПЦР
2.2 Методы
2.2.1 Условия культивирования D.melanogaster
2.2.2 Получение личинок третьего возраста и эмбрионов
2.2.3 Выделение органов и тканей дрозофилы
2.2.4 Выделение геномной ДНК из взрослых особей
2.2.5 Выделение тотальной РНК из биоматериала от дрозофилы
2.2.6 Обратная транскрипция
2.2.7 Полимеразная цепная реакция
2.2.8 ПЦР в реальном времени
2.2.9 Культивирование E.coli
2.2.10 Приготовление компетентных клеток Е.coli и их трансформация
2.2.11 Выделение плазмидной ДНК из E.coli
2.2.12 Разделение фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле
2.2.13 Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля
2.2.14 Клонирование фрагментов гена Grp в экспрессионный вектор рЕТЗО
2.2.15 Секвенирование
2.2.16 Экспрессия конструкций, кодирующих рекомбинантные белки, в клетках E.coli
2.2.17 Выделение рекомбинантных белков из клеток is. coli и очистка методом аффинной хроматографии
2.2.18 Диализ растворов белков

2.2.19 Измерение концентрации белка
2.2.20 Электрофорез белков в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях
2.2.21 Электрофорез в неденатурирующих условиях
2.2.22 Окраска полиакриламидных гелей красителем Coomassie G
2.2.23 Измерение спектра кругового дихроизма
2.2.24 Иммунизация крыс рекомбинантными белками
2.2.25 Взятие крови у крыс и получение сывороток
2.2.26 Титрование сывороток с помощью ИФА
2.2.27 Выделение тотального белка для вестерн-блот гибридизации
2.2.28 Вестерн-блот гибридизация
2.2.29 Биоинформатические методы
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей гена Grp у разных видов семейства Drosophilidae
3.2 Исследование экспрессии гена Grp на уровне транскрипции на разных стадиях развития D.melanogaster
3.3 Сравнение экспрессии гена Grp на уровне транскрипции в разных органах D. melanogaster
3.4 Сравнение экспрессии гена Grp на уровне транскрипции в разных линиях D.melanogaster
3.5 Биоинформатический анализ структуры продукта гена Grp
3.6 Клонирование гена Grp в составе экспрессионного вектора рЕТЗО
3.7 Исследование вторичной структуры рекомбинантного белка Grp с помощью измерения спектра кругового дихроизма
3.8 Иммунизация крыс рекомбинантными белками Grp и GrpN и

обработанные ДНКазой I и не прошедшие ОТ. Для амплификации фрагментов генов Grp и гр49 использовали следующую программу: предварительный этап плавления ДНК 10 мин. при 95°С, затем 40 циклов: плавление 15 сек. при 95°С, отжиг праймеров 30 сек при 55°С, синтез 30 сек при 62°С после синтеза в каждом цикле измерялся уровень флуоресценции в пробах. После завершения ПЦР определяли температуру плавления продуктов для проверки специфичности реакции. Продукт ПЦР также исследовали с помощью электрофореза. Анализ результатов ПЦР проводили с помощью пакета программ Bio-Rad CFX МапацеДверсия 1.6.541.1028).
2.2.9 Культивирование E.coli
Культуры клеток выращивали при 37°С в жидкой или агаризованной питательной среде LB (Luria-Bertani). Для приготовления жидкой среды использовалась готовая сухая смесь LB производства «Amresco» (25 г сухой смеси на 1 л среды). В агаризованную среду добавляли 1,7% агара. Отбор трансформантов, содержащих рекомбинантные плазмиды на основе вектора рЕТЗОа, осуществляли на среде с канамицином (30 мкг/мл). В жидкие среды для выращивания трансформантов добавляли 15 мкг/мл канамицина. При работе с штаммом Rosetta во все среды дополнительно добавляли хлорамфеникол 12мкг/мл для твердой среды и 6 мкг/мл для жидкой среды. Клетки в стерильных условиях засевали в аэрируемые пробирки с питательной средой LB, либо на чашки Петри и выращивали в термостате при 37°С в течение 12-20 часов. Культуры клеток хранили при температуре 4°С, либо в 15% растворе глицерина при -20°С.