Эпигенетический статус генов опухолевой супрессии и количественные характеристики циркулирующих ДНК в крови при раке легкого

• Автор: Пономарева, Анастасия Алексеевна
• Шифр специальности: 03.02.07, 14.01.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Томск
• Количество страниц: 127 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1Л Роль эпигенетической регуляции в развитии злокачественных
новообразований
1Л Л Метилирование ДНК в нормальных клетках
1Л .2 Нарушения метилирования ДНК при раке
1.2 Заболеваемость раком легкого
1.3 Белковые маркеры при раке легкого
1.4 Генетические изменения при раке легкого
1.5 Эпигенетические изменения
1.6 Внеклеточные ДНК, циркулирующие в крови
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Материалы
2.1.1 Характеристика материала исследования
2.1.2 Реактивы и препараты
2.1.3 Оборудование
2.2 Методы
2.2.1 Взятие образцов крови
2.2.2 Приготовление элюатов с поверхности форменных
элементов крови
2.2.3 Выделение циркулирующих ДНК из плазмы и элюатов
с клеточной поверхности
2.2.4 Бисульфитная модификация ДНК
2.2.5 Приготовление стандартов для количественной полимеразной
цепной реакции в режиме реального времени
2.2.6 Определение концентрации циркулирующих ДНК в крови

2.2.7 Получение геномной ДНК для приготовления положительного контроля в метил-специфичной полимеразной цепной реакции
2.2.8 Приготовление стандартов для количественной метил-специфичной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
2.2.9 Количественная метил-специфичная полимеразная цепная
реакция в режиме реального времени
2.2.10 Иммунохимический анализ маркеров РЭА, CYFRA
плазме крови
2.3 Статистическая обработка результатов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Количественный анализ фрагментов гена АСТВ и L1NE-1 повторов цирДНК крови у больных хронической обструктивной болезнью и
раком легких
3.2 Исследование уровня метилирования гена RARB2 в цирДНК крови
у больных хронической обструктивной болезнью и раком легких
3.3 Определение индекса метилирования гена RARB2 в цирДНК крови
у больных хронической обструктивной болезнью и раком легких
3.4 Определение индекса метилирования гена RASSF1A в цирДНК крови
у больных хронической обструктивной болезнью и раком легких
3.5 Определение онкомаркеров РЭА, CYFRA 21-1 в крови у больных
раком легкого
3.6 Анализ ассоциации повышенного уровня метилированных аллелей генов RARB2 и RASSF1A и белковых онкомаркеров
(РЭА и CYFRA 21-1)
3.7 Исследование уровня эпигенетических (RARB2, RASSF1A) и белковых (РЭА) онкомаркеров в крови больных раком легкого на этапах динамического наблюдения
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АК - аденокарцинома
БАЛЖ - бронхоальвеолярная жидкость
ВОЗ - Всемирная Организация Здравоохранения
ГТЦ - гуанидина тиоцианат
ИМ - индекс метилирования
МН - микросателлитная нестабильность
МС-ПЦР - полимеразная цепная реакция, специфичная к метилированию
НМРЛ - немелкоклеточный рак легкого
ПГ - потеря гетерозиготносте
ПКРЛ - плоскоклеточный рак легкого
ПНР - полимеразная цепная реакция
РЛ - рак легкого
РЭ А - раковый эмбриональный антиген
скп-цирДНК - циркулирующие ДНК, связанные с клеточной поверхностью
трис - трис-(гидроксиметил)аминометан
цирДНК - циркулирующие ДНК
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
CYFRA 21-1 - фрагмент цитокератина
п - количество человек
NaOAc - натрий уксуснокислый
NP-40 - Nonidet Р
Р - уровень значимости
PBS - 0,01М натрий фосфатный буфер, 0Д5М NaCl, рН7
PMSF - фенилметансульфонилфторид
SDS - до деци л сульфат натрия
ТАЕ - 40мМ трис ацетат, 2мМ ЭДТА, рН8

нескольких генов (CDKN2A, TIMP3, DAPK, MGMT, RARB2, RASSF1A и hTERT) в ряду от атипической аденоматозной гиперплазии до аденокарциномы легких (Licchesi et al., 2008). Кроме того, чувствительность детекции метилированного аллеля в присутствии избытка неметилированного аллеля выше, чем в случае анализа мутаций, что важно для детекции искомой последовательности в присутствии избытка неметилированной ДНК, который характерен как для цирДНК, так и для ДНК, выделенной из опухолевых тканей.
Поиск метилированных генов, которые являются потенциальными онкомаркерами, длительное время проводился методом анализа целевых генов, метилирование которых предположительно играет роль в онкотрансформации. Таким методом было показано, что при PJI с высокой частотой выявляется метилирование генов опухолевой супрессии, которые регулируют рост опухоли за счет участия в сигнальной трансдукции, регуляции клеточного цикла и апоптоза (RASSF1A, CDKN2A, RARB2, FHIT, DAPK, APC, TMS1, DAL-1, FHIT), генов, которые участвуют в клеточной дифференцировке, адгезии и сигнальной трансдукции (GATA, CDH1, CDH13, НОХА) и генов ферментов репарации ДНК (.MGMT; hMLHl и hMSH2).
Недавно методом целевого анализа при помощи количественной ПЦР в реальном времени из 28 потенциально значимых локусов были выбраны 4 (CDKN2A ЕХ2, CDX2, НОХА1 и OPCML), метилирование которых позволяло различать нормальные ткани и опухоли легкого, начиная с IA стадии с чувствительностью 94% и специфичностью 90% (Tsou et al., 2007).
Ниже дана краткая функциональная характеристика генов, детекция метилированных аллелей которых представляется перспективной для ранней диагностики, при оценке прогноза клинического течения РЛ и ответа на терапию. Сведения о частоте выявления эпигенетических изменений в ДНК клеток опухоли представлены в табл. 3.