Характеристика ревертантов к прототрофности штаммов бактерий в условиях аминокислотного голодания

• Автор: Мона Али Фарид Ибрахим Саляма
• Шифр специальности: 03.02.03, 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 118 с. : ил.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Доказательства преадаптивного характера мутаций
Адаптивный характер мутаций
Клетки в условиях аминокислотногоголодания
Механизм возникновения адаптивных мутаций
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Использоемые бактериальные штаммы и питательные
среды
Методы
Характеристика роста штаммов
Определение частоты возникновения реверсий
Флуктуационный тест Лурия-Дельбрюка
Метод Ли и Коулсона
Определение частоты встречаемости ревертантов к
прототрофности в неделящихся клетках бактерий
Регуляция уровня транскрипции лейцинового оперона В.
Subtilis
Выделение хромосомной ДНК
Генетическая трансформация клеток В. subtilis
ПЦР-амплификация фрагмента гена his С
Анализ продуктов амплификации в агарозном геле и очистка
получившихся ПЦР-продуктов
Выделение ДНК из агарозного геля
Рестрикционный анализ ПЦР-фрагментов
Определение нуклеотидной последовательности Парное выравнивание полученных последовательностей

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Характеристика мутации his С штамма SB-3922 В. Subtilis
3.2. Частота спонтанных реверсий к прототрофности в активно
делящихся клетках бактерий
3.3. Частота встречаемости ревертантов в голодающих культурах
3.4. Влияние уровня транскрипции на частоту возникновения
ревертантов в голодающих клетках бактерий
3.5. Влияние системы "стресс - ответа" на частоту возникновения
спонтанных ревертантов
Заключение
Выводы
Литература
Приложение

Актуальность темы. Одним из удивительных свойств микроорганизмов является их быстрая приспособляемость к меняющимся условиям окружающей среды. Объяснение этого феномена привело некоторых исследователей к утверждению положения, что внешняя среда является ведущим фактором в возникновении подобных изменений. Сторонников подобной точки зрения не совсем корректно называют "ламаркистами". Они утверждают, что изменение внешней среды вызывает адекватный ответ в живых организмах, который позволяет им приспособиться к изменившимся условиям.
Классические эксперименты А. Вейсмана и В. Иогансена казалось бы окончательно опровергли подобную точку зрения. Мутации, как основной источник наследственной изменчивости, возникают вне зависимости от конкретных условий среды и не адекватны этим условиям. Взгляд на мутации как на случайные, ненаправленные изменения генотипа, не адекватные вызвавшими их условиям внешней среды, прочно укоренился в биологии, составляя основное содержание эволюционной концепции
Ч.Дарвина. Однако данные последних лет указывают на то, что целый ряд мутаций у микроорганизмов возникает как адаптивный ответ на изменение окружающей среды. Такого рода мутации получили не совсем корректное название "адаптивных" или "направленных".
В известной степени возмутителем спокойствия явилась работа Кэрнса с сотрудниками (Caims et al., 1988), в которой было показано, что мутантные клетки E. coli, не способные сбраживать лактозу, приобретают эту
Далее проводили высев бактерий на агаризованные селективные среды Спицайзена. Подсчет колоний трансформантов осуществляли через 2 дня инкубации при 37°С.
ПЦР-амплификация фрагмента гена his С
Амплификацию фрагмента гена his С проводили по стандартной методике (Sambrook, 2001). Праймеры были синтезированы фирмой Синтол (Россия, Москва), их структура приведена в таблице 3.
Таблица
Структура праймеров, использованных для ПЦР-амплификации фрагмента гена his С В. subtilis
Название праймера Нуклеотидная последовательность 5’—■> 3’
B.sub-HisC- Rev caa-tcc-gag-acc-ggc-gag-ca
B.sub-HisC- For ggc-gct-gca-gga-gtt-tga-gga
ПЦР проводили на приборе MJ Mini Personal Thermal Cycler (Bio-RAD, Сингапур) в режиме, указанном в таблице 4.
Таблица
Температурный режим ПЦР-амплификации фрагмента гена his С В. subtilis
Температура Время Описание этапа
95 °С 2 мин предварительный нагрев
95 °С 30 сек денатурация
59 °С 30 сек отжиг
72 °С 90 сек синтез
72 °С 5 мин окончательный синтез
10°C хранение
у 35 циклов