Бактерии рода Geobacillus из высокотемпературных заводняемых нефтяных пластов и гены биодеградации h-алканов (alkB)

• Автор: Михайлова, Екатерина Михайловна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 144 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

1 ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Распространение, видовое разнообразие и геохимическая деятельность микроорганизмов в месторождениях нефти с температурой выше 50°С
2.1.1 Характеристика нефтяных пластов как среды обитания микроорганизмов
2.1.2 Распространение и геохимическая деятельность микроорганизмов в нефтяных пластах
2.1.3 Метаболическое разнообразие прокариот в нефтяных пластах с температурой выше 50°С
2.2. Использование молекулярно-биологических методов для выявления биоразнообразия микроорганизмов нефтяных пластов
2.3. Деградация углеводородов прокариотами
2.4. Гены ферментативной системы биодеградации н-алканов у аэробных бактерий
2.5. Заключение по обзору литературы
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1 Характеристика нефтяного месторождения Даган
3.2 Отбор проб. Микроорганизмы, использованные в работе
3.3 Состав питательных сред; условия культивирования и учёта микроорганизмов
3.4 Микроскопические методы
3.5 Аналитические методы
3.6 Методы оценки интенсивности анаэробных микробных процессов в пластовых водах
3.7 Изотопный состав углерода нефти и растворенных карбонатов
3.8 Анализ клеточных жирных кислот
3.9 Молекулярно-биологические методы
3.10. Статистическая оценка достаточности размера библиотеки клонов

4 РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1 Распространение микроорганизмов в высокотемпературных горизонтах нефтяного месторождения Даган
4.2 Фенотипические, генотипические и метаболические характеристики аэробных термофильных бактерий из нефтяных пластов
4.3 Использование к-алканов бактериями рода Geobacillus
4.4 Гены ферментативной системы биодеградации н-алканов у бактерий рода Geobacillus и первичная структура генов алкан-гидроксилаз
4.5 Разнообразие генов 16S рРНК и alkB в библиотеках клонов, созданных на основе ДНК и РНК, выделенных из пластовой воды призабойной зоны нагнетательной скважины в период биотехнологического воздействия
4.5.1 Разнообразие генов 16S рРНК представителей домена Archaea в ДНК-библиотеке клонов
4.5.2 Разнообразие генов 16S рРНК представителей домена Bacteria в ДНК-библиотеке клонов
4.5.3 Разнообразие филотипов бактерий в РНК-библиотеке клонов генов 16S рРНК
4.5.4 Детекция генов alkB в ДНК-библиотеке клонов
4.5.5. Статистический анализ библиотек клонов генов 16S рРНК пластовой воды из нагнетательной скважины
5 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
6 ВЫВОДЫ
7 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. ВВЕДЕНИЕ
Первые работы, посвященные микроорганизмам из нефтяных пластов, относятся к началу XX века. С тех пор интерес к микрофлоре нефтяных месторождений не ослабевает. Выделены анаэробные микроорганизмы, относящиеся к различным метаболическим группам: восстанавливающие сульфат, тиосульфат, сульфит, элементную серу, Fe(III); бродильные бактерии, ацетогены и метаногены (Розанова, Кузнецов, 1974; Назина, Беляев, 2004; Magot, 2005). Установлено присутствие аэробных бактерий в пластовых водах нефтяных месторождений (Nazina et al., 2001; Нао et al., 2004a, Wang et al., 2006). Вероятнее всего, эти микроорганизмы проникают в пласт с буровым раствором при разработке месторождения и с нагнетаемой водой при его заводнении. В призабойной зоне нагнетательных скважин присутствует кислород в количестве, достаточном для роста аэробных микроорганизмов. Особый интерес представляют аэробные углеводород-окисляющие бактерии, которые служат первичным звеном в трофической цепи аэробноанаэробного сообщества заводняемого нефтяного пласта, и оказывают влияние на развитие всего сообщества в целом (Назина и соавт., 2003).
Из пластовых вод выделен ряд мезофильных углеводородокисляющих бактерий. Термофильным аэробным бактериям посвящено немного работ. Выделенные из нефтяных пластов микроорганизмы относятся к родам Bacillus, Geobacillus, Thermoactinomyces, Thermus (Назина и соавт., 2000; Yakimov et al., 1997; Nazina et al., 2001; Hao et al., 2004a, b). Изучение углеводородокисляющих бактерий актуально для решения фундаментальных и прикладных задач. При окислении углеводородов бактерии вырабатывают поверхностноактивные вещества, которые существенно изменяют реологические свойства нефти и могут использоваться в технологиях повышения нефтеотдачи. Стимуляция углеводородокисляющих микроорганизмов в пласте также способствует повышению нефтеизвлечения.
В природе наиболее деградированные залежи нефти обнаруживаются при температуре до 80°С (Head et al., 2003). Однако до сих пор неизвестны микроорганизмы, осуществляющие биодеградацию нефти при столь высокой температуре. Имеется обширная информация о структуре и работе alk генов, кодирующих ферменты, ответственные за окисление к-алканов у мезофильных бактерий, тогда как сведений о генетических аспектах биодеградации углеводородов термофильными прокариотами практически нет. К началу настоящей работы в Генбанке было лишь два небольших фрагмента последовательностей alkB генов, кодирующих алкан-монооксигеназу, термофильных бактерий рода Geobacillus.
Для изучения разнообразия микробных сообществ нефтяных пластов сравнительно недавно начали применять методы молекулярной экологии, основанные на анализе генов 16S рРНК, выявленных во фракции ДНК, выделенной из пластовой воды. Подобные

значительно больше, чем в покоящихся, предполагается, что анализ микробного сообщества на основе выделенной РНК помогает выявить метаболически активные группы микроорганизмов (Poulsen et al., 1993; Wawer et al., 1997). Из недостатков метода стоит отметить возможную переоценку микробного разнообразия вследствие различной специфичности праймеров для разных групп микроорганизмов и многокопийности рРНК оперонов некоторых микроорганизмов. Предполагается, что подобная ошибка может в 2-15 раз переоценить истинное разнообразие филотипов сообщества и в среднем находится на уровне 2.5 раз (Moesender et al., 2005).
Такой подход был применен для анализа морского бактериопланктона (Moesender et al., 2005). Состав ДНК- и РНК-библиотек клонов во многом перекрывался, однако были значительные различия. В ДНК-библиотеке преобладали филотипы a-Proteobacteria, в то время как в РНК-библиотеке - y-Proteobacteria,, Кроме того, 25.5% филотипов было обнаружено лишь в ДНК-библиотеке и 21.5% филотипов - лишь в РНК-библиотеке клонов, что еще раз доказывает эффективность одновременного применения нескольких подходов к изучению сложных природных сообществ.
В 2005 году аналогичная работа была проведена для газ-гидратов Мексики (Mills et al, 2005). Тотальные ДНК и РНК были выделены из двух различных слоев газ-гидратов (поверхностного и глубинного), послсдоывательности 16S рРНК бактерий и архей были амплифицированы и их фрагменты клонированы. Разнообразие полученных филотипов определяли с помощью рестрикционного анализа. Классические микробиологические методы анализа сообщества не применяли.
Бактериальные компоненты обоих сообществ были довольно разнообразны и не отличались друг от друга существенно. В библиотеке сообщества верхнего слоя присутствовали последовательности (% от общего количества клонов в ДНК-библиотеке): 5-Proteobacteria (27%), бактерий, ассоциированных с углеводородами (24%>), Firmicutes (18%), Chloroflexi (15%), e-Proteobacteria (12%), Spirochaetales (3%) и неидентифицируемых бактерий (3%). В библиотеке сообщества глубинного слоя не были выявлены последовательности представителей Spirochaetales, однако появились Verrucomicrobiales (4%) и Actinomycetales (2%), процентное соотношение остальных групп практически не изменилось. В РНК-библиотеках клонов обоих слоев доминировали филотипы д-Proteobacteria (86% - для поверхностного слоя и 90% - для глубинного). Минорные филотипы в библиотеке глубинного слоя принадлежали представителям Chloroflexi (6%), Firmicutes (2%), Spirochaetales (2%), а в библиотеке поверхностного слоя присутствовали филотипы Chloroflexi (6%), неидентифицируемых бактерий (6%) и бактерий, ассоциированных с углеводородами (2%). Полученные результаты позволяют авторам