Разработка тест-систем для оценки мукозального и клеточного иммунитета птиц

• Автор: Ирза, Анна Викторовна
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Владимир
• Количество страниц: 152 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Иммунная система птиц
1.1.1. Основные иммунокомпетентные органы птиц
1.1.2. Факторы врожденного иммунитета
1.1.3. Факторы приобретенного иммунитета
1.1.3.1. Клеточный иммунитет
1.1.3.3. Мукозальный иммунитет
1.2. Методы оценки клеточного и мукозального иммунитета
1.2.1. Традиционные методы исследования
1.2.2. Современные методы
1.2.2.1. Клеточный иммунный статус
1.2.2.1. Оценка гуморального иммунитета
1.2.2.2. Количественный метод оценки иммунного ответа - проточная цитофлуориметрия
1.3. Особенности поствакцинального иммунитета у птиц
1.3.1. Живые противовирусные вакцины
1.3.2. Инактивированные противовирусные вакцины
1.3.3. Роль и механизм действия адъювантов в составе вакцин
1.3.4. Мукозальные вакцины
1.4. Обоснование выбора вируса НБ в качестве модели
1.5. Заключение по обзору литературы
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы
2.1.1. Антиген
2.1.2. Вирус контрольного заражения
2.1.3. Животные
2.1.4. Реактивы
2.1.5. Иммуноспецифические компоненты реакции
2.1.6. Растворы, необходимые для постановки реакции
2.1.7. Прочие материалы
2.1.8. Оборудование
2.1.9. Коммерческие наборы
2.2. Методы исследования
2.2.1. Отбор проб для оценки уровня экспрессии цитокинов с помощью ПЦР в реальном времени
2.2.2. Выделение суммарной РНК
2.2.3. ПЦР-РРВ для оценки уровня экспрессии цитокинов
2.2.4. Изготовление образцов вакцин
2.2.5. Реакция гемагглютинации (РГА)
2.2.6. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)
2.2.7. Непрямой вариант ИФА

2.2.8. Выделение лимфоцитов из периферической крови кур
2.2.9. Выделение лимфоцитов из ткани селезёнки кур
2.2.10. Определение протективной защиты на трахеальных органных культурах (ТОК)
2.2.11. Статистический анализ материалов
2.3. Результаты собственных исследований
2.3.1. Разработка методов
2.3.1.1. Отбор проб лакримальной жидкости, смывов зоба и респираторного тракта кур
2.3.1.2. Оптимизация метода отбора и окрашивания пейеровых бляшек
2.3.1.4. Разработка метода выявления специфических к вирусу НБ иммуноглобулинов (IgA, IgG, IgM) в секреторных жидкостях кур в непрямом варианте ИФА
2.3.1.5. Разработка метода подготовки проб для иммунофенотипирования и количественной оценки субпопуляций лимфоцитов с использованием проточной цитофлуориметрии
2.3.1.6. Разработка метода оценки пролиферативной активности лимфоцитов кур с использованием реагента Alamar Blue
2.3.1.7. Разработка метода количественного определения куриного интерферона-у в биологических жидкостях и культуральных суспензиях методом ИФА
2.3.1.8. Разработка метода анализа экспрессии цитокинов кур с помощью ПЦР в режиме реального времени
2.3.2. Применение разработанных методов для комплексной оценки иммунного
ответа
2.3.2.1 Комплексная оценка иммунного ответа после применения коммерческой инактивированной вакцины
2.3.2.2. Исследование мукозального и гуморального иммунного ответа
цыплят на введение вакцин против НБ с различными адъювантами
2.3.2.1..Комплексная оценка иммунного ответа после применения живой вакцины
3. ОБСУЖДЕНИЕ
4. ВЫВОДЫ
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
6.СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
7. ПРИЛОЖЕНИЯ

Список обозначений и сокращений
АГ - антиген АТ - антитело
АЭЭИ - аминоэтилэтиленимин
АБТС - 2, 2-азино-ди-(-3-этилбензтиазолинсульфонат)
ВНБ - вирус ньюкаслской болезни
БСА - бычий сывороточный альбумин
гтц - гуанидинизотиоцианат
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ДСН - додецилсульфат натрия
ИФА - иммуноферментный анализ
КББ - карбонатно-бикарбонатный буфер
КЭ - куриные эмбрионы
МАТ - моноклональные антитела
МНС - главный комплекс гистосовместимости
н-ИФА - непрямой вариант иммуноферментного анализа
НБ - ньюкаслская болезнь
ОП - оптическая плотность
ПБ - пейеровы бляшки
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ПЦР-РРВ - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени
РГА - реакция гемагглютинации
РТГА - реакция торможения гемагглютинации
СПФ - животные, свободные от специфических патогенов
ТБР-Т - трис-буферный раствор
ФБР - фосфатно-буферный раствор
ЭДТА- этилендиаминтетрауксусная кислота
BALT - (от англ. bronchial-associated lymphoid tissue) лимфоидная ткань ассоциированная с дыхательными путями.
САР - частицы - частицы фосфата кальция
CD - кластер дифференциации
CTL - цитотоксические Т-лимфоциты
MALT - (от англ. mucosa-associated lymphoid tissue) лимфоидная ткань ассоциированная со слизистыми CTL - цитотоксические Т-лимфоциты Ct - пороговый цикл
dNTP - дезоксирибонуклеозидтрифосфат Ig - иммуноглобулин IL - интерлейкин IFN - интерферон
GALT - (от англ. gut-associated lymphoid tissue) лимфоидная ткань
ассоциированная с кишечником
mCV - модифицированный кристалл виолет
NALT - (от англ. nasal-associated lymphoid tissue) лимфоидная ткань ассоциированная с дыхательными путями.

энтерические» штаммы стали более популярными, так как они не вызывают вакцинных реакций по крайней мере со стороны респираторного тракта. К последней категории относятся штаммы V4 и Ulster.
1.3.2. Инактивированные противовирусные вакцины
Основной альтернативой живым вакцинам в настоящее время являются инактивированные препараты. Таким, не реплицирующимся в организме птиц вакцинам, отдаётся в последнее время предпочтение благодаря их безвредности.
Инактивированные вакцины обычно индуцируют образование защитных антител в исключительно высоких титрах, которые персистируют длительное время, и поэтому применяются для повторной (бустерной) вакцинации, например, для вакцинации кур-несушек после предварительной иммунизации живыми вакцинами. Так как производство инактивированных вакцин очень трудоёмко и вакцинацию применяют индивидуально, то их использование обходится крайне дорого.
Однако, антигены инактивированных вакцин, вводимые парэнтеральным путем (отличным от пути естественного инфицирования), могут не индуцировать достаточно напряженный иммунитет и часто требуют адъювантов [166]. Разработка вакцин требует наличия рационально подобранных адъювантов, направленных на развитие взаимосвязи между различными антигенными структурами и адъювантом.
1.3.3. Роль и механизм действия адъювантов в составе вакцин
Вакцинные адъюванты - это химические вещества, микробные компоненты, белки, усиливающие иммунный ответ на антигены вакцины. Адъювант представляет собой активизирующее и модулирующее промежуточное звено, действующее на границе между иммунной системой хозяина и вводимым вакцинным инокулятом. Интерес к снижению побочных действий, связанных с введением вакцины, и выработке специфических