Разработка иммуноферментного метода анализа амфетамина и антител к нему в биологических жидкостях человека

• Автор: Киселева, Раиса Юрьевна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 113 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Введение
Список сокращений
1. Литературный обзор
1.1. Объект исследования и его свойства
1.2. Физические свойства амфетамина и его производных
1.3. Химические свойства амфетамина. Воздействие на организм человека
1.4. Методы исследования наркотических веществ и их метаболитов в биологических жидкостях человека
1.4.1. Физико - химические методы
1.4.2. Иммунохимические методы
1.4.3. Иммуноферментный анализ (ИФА)
1.4.3.1. Характеристики качества иммуноферментных тест-систем
1.4.3.2. Иммунохимические свойства антител и методы их исследования
1.5. Определение антител к наркотическим веществам
1.5.1. Антитела к наркотикам, индуцированные у животных
1.5.2. Антитела к наркотикам, индуцированные у людей
2. Материалы и методы исследований
2.1. Материалы исследований
2.2. Методы исследований
2.2.1. Получение реагентов для иммуноферментного анализа определения амфетамина
2.2.2. Синтез конъюгированных антигенов амфетамина с различными белками
2.2.2.1. Синтез конъюгированных антигенов амфетамина с овальбумином
2.2.2.2. Синтез конъюгированных антигенов амфетамина с бычьим сывороточным альбумином (БСА)
2.2.3. Получение антител к амфетамину
2.2.4. Определение сыворотки, содержащей антитела к амфетамину, методом
иммуноферментного анализа
2.2.5. Разработка иммуноферментного анализа определения амфетамина в моче
2.2.5.1. Подбор оптимальных условий проведения иммуноферментного анализа с использованием кроличьих антител к амфетамину
2.2.5.2. Разработка иммуноферментного анализа определения амфетамина в моче с использованием кроличьих антител
2.2.5.3. Подбор оптимальных условий проведения иммуноферментного анализа с использованием овечьих антител к амфетамину
2.2.6. Иммуноферментный анализ определения амфетамина в моче
2.2.7. Сравнительное определение амфетамина в моче методом ГХМС
2.2.8. Разработка иммуноферментного анализа антител к амфетамину в биологических жидкостях человека
2.2.8.1. Определение рабочего разведения анализируемой сыворотки крови и
концентрации антигена, сорбируемого на планшете
2.2.8.2. Определение рабочего разведения анализируемой слюны и концентрации антигена, сорбируемого на планшете
2.2.9. ИФА определения антител к амфетамину в биологических жидкостях человека
2.2.9.1. ИФА определения антител к амфетамину в сыворотке крови человека
2.2.9.2. ИФА определения антител к амфетамину в слюне человека
2.2.10. Выделение антител к амфетамину из сыворотки крови человека
2.2.10.1.Получение сорбента для аффинной хроматографии антител к амфетамину
2.2.10.2. Выделение антител к амфетамину методом аффинной хроматографии

2.2.11. Изучение иммунохимических свойств антител к амфетамину. Определение специфичности и аффинности выделенных на аффинном сорбенте антител к амфетамину
2.2.11.1. Выбор условий проведения ингибиторного ИФА
2.2.11.2. Ингибиторный ИФА для оценки специфичности и аффинности антител к амфетамину
2.2.11.3. Определение специфичности антител к амфетамину
2.2.11.4. Расчёт константы аффинности антител к амфетамину
3. Результаты и их обсуждение
3.1. Получение реагентов для иммуноферментного анализа определения амфетамина
3.1.1. Синтез конъюгированных антигенов амфетамина с различными белками
3.1.2. Получение антител к амфетамину
3.2. Иммуноферментный анализ определения амфетамина
3.2.1. Определение чувствительности разработанного твердофазного ИФА определения амфетамина
3.2.2. Определение специфичности разработанного твердофазного ИФА определения амфетамина
3.2.3. Определение воспроизводимости результатов разработанного метода ИФА определения амфетамина
3.3. Определение амфетамина в биологических жидкостях разработанным твердофазным ИФА и сравнение полученных результатов с другими методами анализа
3.4. Иммуноферментный анализ определения антител к амфетамину и определение его диагностической значимости
3.4.1. Разработка ИФА выявления антител к амфетамину у больных, употребляющих психостимулирующие препараты амфетаминового ряда
3.5. Выделение антител к амфетаминам аффинной хроматографией и исследование их иммунохимических свойств
3.5.1. Исследование иммунохимических свойств антител к амфетамину
3.5.1.1. Определение константы аффинности (Ка) для антител против амфетамина
3.5.1.2. Изучение специфичности аффинно очищенных антител к амфетамину
3.6. Иммуноферментный анализ определения антител к наркотическим веществам в биологических жидкостях человека
3.6.1. Разработка ИФА выявления иммуноглобулинов человека, связывающих конъюгат амфетамин-белок в сыворотке крови
3.6.2. Разработка ИФА выявления иммуноглобулинов человека, связывающих конъюгат амфетамина с белком в слюне
3.7. Определение диагностической значимости разработанного ИФА выявления антиамфетаминаых антител в сыворотке крови людей
3.8. Определение диагностической значимости разработанного ИФА выявления
антиамфетаминовых антител в слюне
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ.
Актуальность проблемы.
В последнее десятилетие Российская Федерация подверглась интенсивной наркоагрессии [67, 68]. Значительный рост потребления наркотических и психоактивных препаратов населением в немедицинских целях приводит к изменению социальной атмосферы в обществе: увеличивается количество преступлений, в большей степени распространяются заболевания (в т.ч. инфекционные), снижается культурный потенциал населения. В настоящее время по данным Минздрава России в стране в той или иной степени связаны с употреблением наркотических веществ около 5 млн. человек. Проблема противодействия нарастающему наркопотреблению вышла за чисто медицинские рамки и стала актуальной практически во всех областях производственной и общественной деятельности. Решение многих вопросов, связанных с противодействием распространению наркомании и алкоголизма, невозможно без достижений современной медицины и передовых методов диагностики.
Создавшееся положение дел обуславливает потребность в доступных и достоверных методах, позволяющих при массовых обследованиях быстро выявлять факты злоупотребления психоактивными средствами. Одним из таких направлений является разработка и производство тест-систем для надежной диагностики употребления различных видов наркотических веществ, а также создание методов профилактики и ранней диагностики, позволяющих выявить группы риска среди населения и предупреждать возникновение у человека зависимого от наркотика состояния. Принципиальные требования, предъявляемые к таким тестам - методическая простота анализа, высокая производительность и специфичность (минимальный процент ложноположительных и ложноотрицательных диагнозов).
На сегодняшний день в медицинской практике широкое применение нашли иммунохимические методы анализа, используемые для определения самых разных физиологически активных веществ и объектов - от низкомолекулярных регуляторов метаболизма до маркеров раковых клеток и патогенных микроорганизмов. Уникальная специфичность реакции антиген - антитело позволяет достоверно выявлять индивидуальные соединения в биопробах сложного состава, не прибегая к их предварительной обработке и фракционированию. Наиболее перспективным методом анализа среди прочих является иммуноферментный метод. Метод иммуноферментного анализа (ИФА) удовлетворяет этим требованиям и позволяет в течение 2-3 часов получить результаты анализа многих пациентов.

где О — число отрицательных проб, правильно распознанных тест-системой;
ЛП — число ложноположительных результатов, соответствующее числу отрицательных проб, ошибочно распознанных тест-системой как положительные.
Например, при исследовании 100 отрицательных стандартных образцов было получено 85 отрицательных и 15 положительных результатов, то есть 15 образцов были оценены неправильно. Расчет специфичности по формуле выглядит следующим образом:

Специфичность = х 100% = 85%
85 +
Использование тест-систем с невысокой специфичностью приводит к частой выдаче ложноположительных результатов, что обусловливает гипердиагностику инфекционных заболеваний, выбраковку неинфицированной доброкачественной донорской крови (плазмы) и перерасход средств референтной (подтверждающей) лабораторной диагностики (если таковая проводится). Дополнительным показателем качества тест-систем является точность, для расчета которой используются результаты анализа как с положительными, так и с отрицательными стандартными образцами:
Точность =
общее количество образцов
где П — число положительных проб, правильно распознанных тест-системой;
О — число отрицательных проб, правильно распознанных тест-системой;
под общим числом образцов подразумеваются все положительные и отрицательные стандартные образцы, использованные для проверки качества тест-системы.
Используя данные из примеров расчета чувствительности и специфичности, можно получить следующее значение точности:

Точность = ——- X100% = 86.9%
30 +
Из приведенных расчетов видно, что чем меньше число ложноотрицательных результатов, тем выше чувствительность, и чем меньше ложноположительных результатов, тем лучше специфичность. В случае отсутствия неправильных результатов оба показателя равны 100%. Однако необходимо иметь в виду, что данные, полученные при использовании одних стандартных панелей, могут отличаться от результатов тестирования с другими стандартными панелями. Немаловажно и то, что ни одна панель не может учесть всего иммунологического разнообразия искомого вещества, определяемого в материале десятков и сотен тысяч больных. Поэтому полной гарантии