Структурно-функциональная и генетическая характеристика V антигена Yersinia pestis

• Автор: Светоч, Татьяна Эдуардовна
• Шифр специальности: 03.02.03, 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Оболенск
• Количество страниц: 140 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ,
ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Открытие V антигена, условия биосинтеза, выделение, очистка и физико-химические свойства
1.2 V Антиген как фактор патогености
1.2.1 Регуляторная функция V антигена
1.2.2 Иммуномодулирующая функция
1.2.3 Функция контроля транслокацииУор эффекторов
1.3 Генетическое разнообразие и трехмерная структура белка БсгУ
1.4 Иммуногенная активность V антигена
1.5 V антиген и вакцинопрофилактика чумы
1.6 Заключение по обзору литературы
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Штаммы микроорганизмов
2.2 Плазмиды
2.3 Лабораторные животные
2.4 Среды и условия культивирования
2.5 Секвенирование гена 1сгУ
2.6 Генно-инженерные манипуляции
2.6.1 Молекулярное клонирование гена 1сгУ
2.7 Аналитическая индукция синтеза V антигена в клетках штамма-продуцента
2.8 Выделение и очистка ЬсгУ
2.9 Изучение физико-химических свойств V антигена
2.10 Структурный анализ V антигена
2.11 Вестерн - блот анализ V антигена
2.12 Иммуноферментный анализ

2.13 Изучение вирулентности штаммов Y. pestis с различными структурными вариантами V антигена
2.14 Изучение иммуногенной активности препаратов V антигена
Y. pestis с различной аминокислотной последовательностью
Глава 3 ПОЛИМОРФИЗМ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОВ IcrV И СООТВЕТСТВУЮЩИХ ИМ ПОЛИПЕПТИДОВ Т. pestis
3.1 Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей IcrV генов и кодируемых ими аминокислотных последовательностей белков
Y. pestis
3.2 Компьютерное моделирование трехмерной структуры различных вариантов V антигена Y. pestis
3.3 Влияние замены аминокислотных остатков на структуру LcrV
Y. pestis
3.4 Вирулентность штаммов Т. pestis с различными структурными вариантами V антигена
3.5 Обсуждение
Глава 4 КОНСТРУИРОВАНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ V АНТИГЕНА Y. pestis
4.1 Молекулярное клонирование IcrV гена в E
4.2 Аналитическая индукция синтеза, выделение и очистка рекомбинантного V антигена
4.3 Изучение некоторых физико-химических свойств V антигена
4.4 Обсуждение
Глава 5 ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ V
АНТИГЕНА Y. pestis С РАЗЛИЧНОЙ АМИНОКИСЛОТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬЮ
5.1 Способность препаратов V антигена Y. pestis с различной аминокислотной последовательностью индуцировать продукцию антител
5.2 Изучение протективной активности препаратов рекомбинантного V антигена Y.pestis с различной аминокислотной последовательностью
5.3 Обсуждение
ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
ПРИЛОЖЕНИЯ

Terminator v. 3.1 с последующим анализом на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3130 XL (Applied Biosystems, США).
2.6 Генно-инженерпые манипуляции
Рестрикционно-лигазные работы выполняли по руководству Т. Маниатис и др. [10]. Использовали ферменты производства MBI Fermentas (Латвия).
Передачу рекомбинантных плазмид в штаммы E. coli DH5a и BL21(DE3) осуществляли кальциевым методом трансформации [59] и электропорации [76].
При скрининге клонов трансформантов E. coli для выделения плазмидной ДНК использовали щелочной метод Н.С. Birnboim и I. Doli [36] или набор Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Sistem (Promega) согласно инструкции фирмы производителя.
2.6.1. Молекулярное клонирование гена lerV
При анализе генома T. pestis С02 с использованием Интернет-ресурса NCBI выявлена открытая рамка считывания 981 п.о., кодирующая белок LcrV. Для клонирования структурной части гена lcrV в составе экспрессирующего вектора рЕТ32Ь(+) был осуществлен дизайн праймеров, содержащих сайты для эндонуклеаз рестрикции Ndel и HindIII.
Vf 5' - GGCATATGATTAGAGCCTACGAAC -3'
Vrev 5’ - GGAAGCTTTCATTTACCAGACGTGTC-3'
ПЦР проводили в реакционной смеси, содержащей 1,5 мМ MgCl2, смесь dNTP - по 2,5 мкМ каждого (Fermentas, Литва), по 10 пМ прямого и обратного праймеров и 1 единицу Taq-полимеразы (Fermentas, Литва), 10 нг плазмидной ДНК соответствующего штамма. Реакцию проводили на амплификаторе Gene Amp PCR System 2700 (Applied Biosystems, США) в режиме, описанном выше.
Полученный ПЦР-фрагмент очищали с использованием DNA Extraction Kit (Fermentas UAB, Литва). Фрагменты ДНК обрабатывали последовательно фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I и Т4 полинуклеотидкиназой, лигировали "сами на себя", подвергали рестрикции эндонуклеазами Ndel и HindIII и лигировали с обработанным соответствующими рестриктазами и дефосфорилированым вектором рЕТ32Ь(+). Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E. coli DH5a. Отбор трансформантов проводили по фенотипу Арк на плотной питательной среде LB с ампициллином (50 мкг/мл). Скрининг рекомбинантных плаз-