Разработка методов очистки белков адсорбционной хроматографией на ионообменниках на примере пероксидазы хрена и лизостафина

• Автор: Смотров, Олег Игоревич
• Шифр специальности: 03.02.03, 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Оболенск
• Количество страниц: 123 с. : ил.

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ,
ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ
Введение
Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1 Л. Физико-химические основы очистки белков
1ЛЛ. Осаждение белков солями и органическими растворителями
1Л .2. Хроматографическое разделение белков
1 Л.2Л. Ионный обмен
1 Л.2.2. Аффинное взаимодействие
1Л .2.3. Ковалентная аффинная хроматография
1.1.2.4. Гидрофобная хроматография
1.1.2.5. Металлохелатная хроматография
1.1.2.6. Хроматография на триазиновых красителях
1.1.2.7. Адсорбционное взаимодействие
1.1.2.8. Гель-фильтрация
1.1.2.9. Жидкофазное распределение белков
1.1.2.10. Ультрафильтрация и диализ
1.2. Лизостафин. Получение, свойства, применение
1.2.1. Открытие лизостафина и других глицилглициновых протеаз
1.2.2. Биосинтез и генетический контроль лизостафина
1.2.3. Лизостафинрезистентность
1.2.4. Методы выделения и очистки лизостафина
1.2.5. Методы определения активности лизостафина
1.2.6. Физико-химические свойства лизостафина
1.2.7. Обоснование применения лизостафина в медицине и ветеринарии

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Штаммы микроорганизмов
2.2. Экспериментальные животные
2.3. Среды и условия культивирования
2.4. Биохимические методы
2.4.1. Использование метода адсорбционной хроматографии на силохроме для получения лизостафина
2.4.2. Использование метода адсорбционной хроматографии на КМ- и ДЭАЭ-целлюлозе для получения пероксидазы хрена
2.5. Определение ферментативной активности и чистоты
полученных белков
2.6. Определение ионогенных групп каталитического центра лизостафина и лизоцима методом кинетико-термодинамического анализа
Глава 3. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Разработка метода адсорбционной хроматографии на ионообменниках
3.1.1. Очистка пероксидазы хрена на КМ- и ДЭАЭ-целлюлозах
3.1.2. Очистка лизостафина адсорбционной хроматографией на силохроме
3.1.3. Обсуждение
3.2. Оптимизация условий культивирования Staphylococcus simalans biovar staphylolyticus
3.2.1. Выбор основы питательной среды
3.2.2. Влияние pH среды и времени культивирования на рост 5. simulans и секрецию лизостафина
3.2.3. Оптимизация концентрации питательных веществ при культивировании S. simulans
3.2.4 Особенности культивирования 5'. «лим/ага в биореакторе
3.2.5. Обсуждение
3.3. Разработка кинетико-термодинамического метода определения ионогенных групп каталитического центра ферментов (на примере лизоцима и лизостафина)
3.3.1. Обсуждение
3.4. Использование лизостафина для лечения стафилококковых поражений
у экспериментальных животных
3.4.1. Обсуждение
Заключение
Выводы
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Получен лишь один более или менее удовлетворительный адсорбент для очистки белков - гидроксил апатит кальция [21]. Хроматография на гидро-ксилапатите применяется из-за ограниченной емкости, как правило, на одной из последних стадий очистки. Сам метод по существу является методом проб и ошибок, то есть заранее нельзя сказать будет ли очищен нужный белок этим методом или нет. Наконец, следует указать, что сорбент используется однократно и для следующего раза требуется его замена.
Несмотря на это, метод иногда используется, особенно после того, как был разработан НА-ультрагель - шарики геля, покрытые гидроксилапатитом. Такой сорбент превосходит другие формы гидроксилапатита и имеет сравнительно большую адсорбционную емкость [70].
1.1.2.8. Гель-фильтрация
В ранее описанных методах белки переходят из жидкой фазы в твердую (сорбент, осадок) и обратно. Более мягкими способами являются те, при которых белки находятся в процессе очистки в одной фазе, то есть в растворе. К ним относится гель-хроматография, сравнительно редко применяемые электрофоретические методы, методы фазового распределения и ультрафильтрация.
Гель-хроматография (или гель-фильтрация) впервые была описана в конце 50-х годов [82] и вскоре широко начала применяться особенно на лабораторном уровне. При гель-хроматографии используются поперечно сшитые гели, получаемые в виде шариков (гранул) определенного размера. Гранулы пронизаны порами, через которые могут проходить белки лишь до определенного размера. Белки, которые частично входят в поры, движутся в основном между гранулами, путь их от верха до низа колонки короче и по-