Характеристика взаимодействия Na/K-АТРазы и NMDA-рецептора в гранулярных клетках мозжечка

• Автор: Аккуратов, Евгений Евгеньевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 87 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1Л. Общая характеристика Na/K-АТРазы
1.2. Каталитический цикл Na/K-АТРазы
1.3. Соединения класса кардиотонических стероидов
1.4. Участие Na/K-АТРазы в клеточной сигнализации
1.5. NMDA-рецептор: общая характеристика
1.6. Участие NMDA-рецептора в клеточной сигнализации
1.7.Предпосылки взаимодействия Na/K-АТРазы и NMDA-рецептора
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Получение первичной культуры гранулярных клеток мозжечка крыс
2.2. Получение суспензии гранулярных клеток мозжечка крыс
2.3. Инкубация первичной культуры и суспензии гранулярных клеток с лигандами
2.4. Иммунопреципитирование
2.5. Метод Western blotting
2.6. Определение концентрации белка
2.7. Определение активности Na/K-АТРазы по высвобождению неорганического фосфата
2.8. Определение активности Na/K-АТРазьт по измерению поглощенного иона Rb+
2.9. Иммуноцитохимические методы
2.10. Метод проточной цитометрии
2.11. Статистическая обработка результатов
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Характеристика первичной культуры гранулярных клеток мозжечка крыс
3.2. Анализ структурного взаимодействия Na/K-АТРазы и NMDA-рецептора
3.3. Влияние уабаина на активацию сигнальных каскадов при кратковременной инкубации
3.4. Влияние уабаина на активность NMDA-рецепторов
3.5. Эффект долговременной инкубации нейронов с уабаином

3.6. Влияние ИМОА-рецептора на активность Ыа/К-АТРазы
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
ЦИТИРУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АФК - активные формы кислорода БСА — бычий сывороточный альбумин КТС — кардиотонические стероиды ПААТ - полиакриламидный гель Akt - протеинкиназа В
АМР А - 2-амино-3-(5-метид-3-оксо-1,2-оксазол-4-ил)пропановая кислота
ВАРТА - 1,2-ди(2-аминофенокси)этан-1Ч,Т4,14,М-тетраацетат
ECL — усиленная хемилюминесценция
EGFR - рецептор эпидерального фактора роста
Fluo-3-AM - пентаацетоксиметиловый эфир [2-амино-5-(2,7-дихлор-6-гидрокси-3-оксоксантенил)фснокси]-2-(2-амино-5-метилфепокси)этаи-КК]’'ЛЧ'-тетрауксусная кислота
FSC - прямое светорассеивание
МАРК - митоген-активируемые протеинкиназы
NAC - N-ацетилцистеин
NMDA - М-мегил-О-аспартат
PBS - фосфатный буфер
Р1 - йодистый пропидий
PI3K - фосфоинозитол-3-киназа
РКС - протеинкиназа С
РКА - протеинкиназа А
SSC - боковое светорассеивание
TBS — трис-солевой буфер
рецептором была произведена серия ’экспериментов, в которой мы инкубировали препараты с уабаином, затем проводили фиксацию клеток и последующее иммуноцитохимическос окрашивание на NR1-субъединицу NMDA-рецепторов (Ліеха Fluor 488) и a-субъединицы Na/K-АТРазы (Alexa Fluor 546). Анализ препаратов производили на конфокальном микроскопе (рис. 23).

NR1 І «St Т
9 I
um

• Ff

JrJSL

1 ß
'ff
Merged і •••*

Merged t ' А У П У" у. 'Щ ■ -■ •
Рис. 23. Им.чуноцнтохимичсский анализ ко-локализации ні- (А-В) и аЗ-субьединнц (Г-Е) 1Ча/К-АТРазы и NRl-cyбъeдиllицы КМОА-рецепторов. Образцы А, Г -окрашивание антителами на N1*1 -субъединицу N311^^4(011тора (АІеха ЕІиог 488), Б, Д - окрашивание антителами на а1- и аЗ-субьсдиницу №/К-АТРазы соответственно (АІеха ЕІиог 564), В, Е - объединение совместного окрашивании на а 1-субъединицу и N1*1 -субъединицу и на пЗ-субъсдиницу и N1*1-субъединицу соответственно.
На полученных после иммуноцитохимического окрашивания картинах видно, что как а 1-субъединица Ыа/К-АТРазы и N111 -субъединица МЗЮА-рецептора, так и аЗ-субъединица Иа/К-А'ГРазы и N1* 1 -субъединица ЫМПА-рецсптора локализованы в одних и тех же частях тела клетки и аксональных отростков. Суммируя данные, полученные двумя различными методическими подходами, мы можем сделать вывод о том, что Ыа/К-АТРаза и ЫМОА-рецепторы ко-локализованы в нейрональных клетках и способны формировать комплексы, исследование функциональных свойств которых стало нашей следующей задачей.