Состав и осахаривающая способность ферментных препаратов, полученных с помощью новых рекомбинантных штаммов Penicillium verruculosum

• Автор: Правильников, Артем Геннадиевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 104 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ РАСТЕНИЙ И ИХ СВОЙСТВА
1.1. Целлюлоза
1.2. Гемицеллюлозы и пектины
1.3. Лигнин
ГЛАВА 2. ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЖЕРЖАЩИЕ МАТЕРИАЛЫ (ЦСМ)
2.1. Общая характеристика состава ЦСМ
2.2. ЦСМ как перспективный источник сырья и энергии
2.3. Предобработка целлюлозы и целлюлозосодержащих материалов
ГЛАВА 3. БИОКАТАЛИТИЧЕСКАЯ ДЕГРАДАЦИЯ ЦСМ
3.1. Современная классификация целлюлаз
3.2. Основные ферменты целлюлолитического комплекса
3.3. Механизм биокаталитической деградации целлюлозы
3.4. Факторы, влияющие на эффективность ферментативного гидролиза целлюлозы
ГЛАВА 4. СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ПОЛУЧЕНИЮ НОВЫХ ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ ЦЕЛЛЮЛАЗ
4.1. Общая характеристика подходов к оптимизации состава ферментных комплексов
4.2. Система экспрессии в грибах рода Pénicillium
И. ЭКСПЕРЕМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 5. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ
5.1. Ферментные препараты
5.2. Субстраты
5.3. Прочие реактивы
5.4. Хроматографические сорбенты

5.5. Получение протопластов и проведение трансформации штамма-реципиента гриба Р. verruculosum
5.6. Культивирование трансформантов
5.7. Метод определения компонентного состава ферментных препаратов
5.8. Определение концентрации белка
5.9. Определение биохимических характеристик ферментов
5.10. Методы определения активности ферментов
5.11. Масс-спектрометрический анализ трипсиновых гидролизатов белков
5.12. Определение температурного и pH-оптимума действия ферментных препаратов
5.13. Изучение термостабильности ферментных препаратов
5.14. Гидролиз ЦСМ
III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 6. Получение ферментных препаратов, полученных с помощью новых рекомбинантных штаммов Р. verruculosum
6.1. Трансформация штамма - реципиента Р.verruculosum
6.2. Результаты первичного скрининга трансформантов «тандем»
6.3. Результаты первичного скрининга трансформантов «дуплет»
6.4. Результаты первичного скрининга трансформантов «триплет»
6.5. Получение сухих ферментных препаратов
ГЛАВА 7. Физико-химические свойства новых ферментных препаратов, полученных с помощью рекомбинантных штаммов Р.verruculosum
7.1. Анализ ферментных препаратов методом ДДС-электрофореза в денатурирующих условиях
7.2. Анализ активностей ферментных препаратов по отношению к различным субстратам
7.3. pH- и температурные оптимумы активности и стабильности ферментных препаратов
ГЛАВА 8. Определение компонентного состава новых рекомбинантных ферментных препаратов

ГЛАВА 9. ВЕРИФИКАЦИЯ УРОВНЯ ЭКСПРЕСИИ ФЕРМЕНТОВ НОВЫХ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ Р. УЕЫШСШСШМ ОСАХАРИВАЮЩЕЙ СПОСОБНОСТЬЮ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ ЦСМ
9 Л. Результаты гидролиза измельченной микрокристаллической целлюлозы
9.2. Результаты гидролиза измельченной обессмоленной сосновой древесины
9.3. Результаты гидролиза измельченной осиновой древесины
9.4. Результаты гидролиза измельченной багассы
Выводы
Список литературы

Особенностью дикого штамма Р.erruculosum WA 30 являлась способность к гидролизу КМЦ. Он также обладал целлобиазной активностью, которая более чем в 10 раз превосходилацеллобиазную активность Г.ree.se/ [134].
Первоначальная продуктивность дикого штамма Р.уеггиси1озит ¥А 30 составляла около 7 г/л секретируемого белка в культуральной жидкости (КЖ). Такая продуктивность довольно низка по сравнению с промышленными штаммами-продуцентами целлюлаз на основе Т. гееБе1 (до 100 г/л).
С целью увеличения продуктивности штамм УА 30 подвергли серии последовательных мутагенезов с использованием УФ-облучения после обработки 1-метил-З-нитро-1-нитрозогуанином (рис.9).
Полученные штаммы Р.erruculosum В1-221-151 и В221-6 обладали высокой продуктивностью внеклеточных ферментов целлюлазного и гемицеллюлазного комплекса, которая составляет 30-40 г/л. Биосинтез ферментов в целлюлолитических штаммах низших грибов индуцируется целлюлозой, а также продуктами ее деструкции и в большинстве случаев подвержен катаболитной репрессии глюкозой. Однако катаболитная репрессия биосинтеза карбогидраз в полученных мутантных штаммах Р.уеггисЫовит В1-221-151 и В221-6 была значительно снижена. Это явилось значительным преимуществом перед исходным диким штаммом и позволило проводить периодические подпитки растущей культуры клеток гриба глюкозой. Целенаправленные изменения pH в процессе ферментации позволяют влиять на состав целлюлазного комплекса.
Некоторые побочные активности, как например, гемицеллюлазная, амилазная и целлобиазная становятся выше при более высоких значениях pH [135].
Следует отметить, что получение перспективных штаммов с устойчивой способностью к сверхсинтезу необходимых ферментов является весьма непростой задачей, так как многие мутантные штаммы со временем теряют такую способность. Однако, мутантные штаммы Р. геггиси1о.шт В1-221-151 и В221-6 обладают стабильной продуктивностью и секрецией гидролитических ферментов, что было неоднократно доказано при пересевах штаммов на селективные среды [136].