Регуляция свободнорадикальных процессов и апоптоза при окислительном стрессе

• Автор: Даниленко, Алеся Олеговна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Ростов-на-Дону
• Количество страниц: 165 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ
СОДЕРЖАНИЕ

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Свободнорадикальные процессы и их регуляция
1.2. Биохимические механизмы апоптоза и роль митохондрий в программируемой клеточной гибели
1.3. Свободнорадикальные аспекты патологического процесса при болезни Паркинсона
Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Постановка эксперимента
2.2. Клинические наблюдения
2.3. Получение биологического материала
2.3.1. Получение плазмы крови
2.3.2. Приготовление суспензии эритроцитов
2.3.3. Приготовление гемолизатов
2.3.4. Получение суспензии лимфоцитов
2.3.5 Получение лизата лимфоцитов и митохондрий
2.4 Препаративные методы исследования
2.4.1. Получение фракции митохондрий ступенчатым центрифугированием
2.5. Биохимические и биофизические методы исследования
2.5.1 Хемилюминесцентный анализ плазмы крови в системе Н202-люминол
2.5.2. Определение содержания метаболитов оксида азота
2.5.3. Экстракция липидов
2.5.4. Определение содержания диеновых конъюгатов
2.5.5. Определение содержания продуктов ПОЛ, реагирующих с 2-
тиобарбитуровой кислотой
2.5.6. Определение содержания шиффовых оснований
2.5.7. Определение суммарной пероксидазной активности
2.5.8. Определение активности супероксиддисмутазы
2.5.9. Определение активности каталазы

2.5.10 Определение оксидазной активности церулоплазмина
2.5.11 Определение активности глутатионпероксидазы
2.5.12 Определение активности глутатион-Б-трансферазы
2.5.13 Определение активности глутатионредуктазы
2.5.14 Определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы
2.5.15 Определение содержания восстановленного глутатиона
2.5.16 Определение структурных параметров биомембран с помощью
флуоресцентного зонда пирена
2.5.16.1 Определение относительной микровязкости липидного бислоя и микровязкости зон белок - липидных контактов мембран
2.5.16.2 Определение эффективности безызлучательного переноса энергии с остатков триптофана мембранных белков на пирен
2.5.16.3 Определение полярности липидной фазы и зон белок -липидных контактов мембран
2.5.17 Определение поверхностного заряда биомембран
2.5.18 Определение интенсивности апоптоза лимфоцитов
2.5.19 Определение активности каспазы
2.5.20 Определение содержания гемоглобина
2.5.21 Определение содержания общих липидов
2.5.22 Определение общего белка
2.5.23 Определение активности сукцинатдегидрогеназы
2.6. Статистическая обработка результатов исследования
Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1 Интенсивность свободнорадикальных процессов и их регуляция в
митохондриях клеток больших полушарий головного мозга крыс при ГБО-индуцированном окислительном стрессе и действии БкС)
3.2 Активность каспазы-3 в клетках больших полушарий головного мозга
крыс при ГБО-индуцированном окислительном стрессе и действии 8к(1
3.3 Интенсивность свободнорадикального окисления и его регуляция в крови крыс при ГБО-индуцированном окислительном стрессе и действии БкСП
3.4 Структурное состояние, поверхностный заряд и уровень апоптоза клеток крови крыс при ГБО-индуцированном окислительном стрессе и
действии 8кС>1
3.5 Клинические наблюдения. Свободнорадикальные процессы и их регуляция в крови при нейродегенеративном процессе (на примере болезни Паркинсона)
Глава 4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

которая служит точкой пересечения рецепторного и митохондриального путей активации каспаз (Eamshaw et al., 1999).
Митохондриям принадлежит одна из ведущих ролей в осуществлении апоптоза у млекопитающих. Выход цитохрома с из этих органелл считается этапом перехода апоптоза в необратимую стадию (Осипов и др., 2006). Сигналы от рецепторов смерти или от поврежденных участков клетки сходятся на них, вызывая повышение проницаемости обеих мембран, снижение мембранного потенциала и высвобождение белков апоптоза - апоптоз-индуцирующего фактора (AIF) (Susin et al., 2000), SMAC (second mitochondria-derived activator of caspases) и некоторых прокаспаз - из межмембранного пространства. Высвобождение этих белков происходит вследствие открытия высокопроницаемого канала — так называемой митохондриальной поры, состоящей из транслокатора адениновых нуклеотидов, потенциал-зависимого анионного канала (порина) и бензодиазепинового рецептора внешней мембраны митохондрий. С нею ассоциированы также другие белки: члены семейства Вс1-2, циклофилин Д и ферменты энергетического метаболизма — гексокиназа и креатинкиназа. При связывании ионов Са2+ этот комплекс образует мембранную пору диаметром 2,6-2,9 нм, способную пропускать низкомолекулярные вещества с Mr = 1500, что приводит к быстрому освобождению Са2+, снижению АТт и высокоамплитудному набуханию митохондрий (Pozzan, Rizzuto, 2000).
Набухание митохондрий сопровождается выходом в цитоплазму специфических апоптозных белков и цитохрома с. Там он связывается с Apaf-1 (apoptotic protease activating factor-1) и формирует так называемый апоптосомный комплекс, инициирующий активацию каспазного каскада (Adrain, Martin, 2009). С помощью Smac и Omi/HtrA2 (Omi stress-regulated endopeptidase/high temperature requirement protein A2) цитохром с запускает Apaf-1-зависимую активацию каспазы-9 (Budihardjo et al., 1999). Каспаза-9 активирует каспазы-3 и -7; те в свою очередь расщепляют различные белки, приводя к появлению биохимических и морфологических признаков апоптоза (Robertson et al., 2000).
Цитохром с связан с внутренней мембраной митохондрий отрицательно заряженными фосфолипидами, преимущественно кардиолипином. Эта связь обусловлена, с одной стороны, электростатическим взаимодействием между положительно заряженными остатками лизина в цитохроме с и отрицательно