Формирование резистентности у вируса простого герпеса к Н-фосфонату ацикловира

• Автор: Гуськова, Анна Алексеевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 124 с. : ил.

1. Введение
2. Обзор литературы
2.1. Вирус герпеса простого тип
2.1.1. Характеристика ферментов вируса герпеса простого
типі
2.1.2. .Тимидинкиназа ВПГ
2.1.2.1. Доноры фосфора
2.1.2.2. Акцепторы фосфора. Противогерпетические препараты
2.1.2.3. Механизм действия тимидинкиназы вируса герпеса простого тип
2.1.2.4. Структура активного центра тимидинкиназы вируса герпеса простого тип
2.1.3. ДНК-полимераза ВПГ
2.2. Исследование мутантных генотипов штаммов ВПГ-1, резистентных к антигерпетическим препаратам
3. Экспериментальная часть
3.1.Обоснование работы и поставленные задачи
3.2. Материалы и методы
3.2.1.Материалы и оборудование
3.2.1. Методы
3.3. Результаты и обсуждение
3.3.1. Изучение генов JL23 и 30 ВПГ-1 штаммов Ь2 и 132ГК
3.3.1.1. Выделение и характеристика тимидинкиназы ВПГ
эталонного штамма Ь2
3.3.1.2. Изучение структуры генов ТК и ДНК-полимеразы ВПГ
штаммов Ь2 и Ь2/Т<
3.3.1.3. Установление ферментативной активности
тимидинкиназы штамма Ь2Л1

3.3.2. Изучение генов UL23 и UL30 ВПГ-1 штаммов, резистентных к Н-фосфонату ацикловира
3.3.2.1. Анализ генаUL23 (тимидинкиназы)
3.3.2.2. Анализ гена UL30 (ДНК-полимеразы)
4. Общее заключение
4.1. Анализ связи между структурой генов ТК и ДНК-полимеразы и
резистентностью к АСУ и HpACV
5. Выводы
6. Список литературы
7. Список сокращений
8. Благодарности
9. Приложение
10. Приложение
1. Введение.
Одним из самых распространенных патогенов человека является вирус простого герпеса первого типа (ВПГ-1). По данным всемирной организации здравоохранения носителями данного вируса являются 95% населения Земли. У большинства инфицированных людей данное заболевание протекает в виде везикулярных высыпаний на слизистых оболочках. Однако при иммунодефицитном состоянии пациента, которое может быть вызвано ВИЧ-инфекцией или процедурами, необходимыми при пересадке органов, ВПГ-1 часто приводит к летальному исходу. ВПГ-1, попадая внутрь организма, остаётся там пожизненно. В настоящий момент не разработано лекарственных средств, которые полностью уничтожали бы ВПГ-1. За последние полвека было предложено много антигерпетических средств различной природы, однако, наибольшее распространение получили модифицированные нуклеозиды, в том числе ациклические нуклеозидные аналоги (ацикловир, ганцикловир и др.), некоторые из них вошли в широкую медицинскую практику для терапии герпетических инфекций.
Механизм действия таких нуклеозидных препаратов хорошо известен. Сначала при помощи вирусного фермента - тимидинкиназы - осуществляется фосфорилирование нуклеозида до нуклеозид-5’-монофосфата, затем происходят два последовательных фосфорилирования с использованием ферментов клетки-хозяина до соответствующего трифосфатного производного нуклеозида. На следующем этапе, полученный модифицированный нуклеотид включается вирусспецифической ДНК-полимеразой во вновь синтезируемую цепь ДНК, что приводит к терминации биосинтеза вирусной ДНК.
Однако длительное применение нуклеозидных антигерпетических препаратов приводит к появлению штаммов ВПГ-1, устойчивых к действию этих соединений. Резистентность ВПГ-1 к нуклеозидным препаратам обусловлена одним из следующих факторов или их сочетанием: (а) полной потерей активности, изменением субстратной специфичности или понижением

Температура 16°С, ночь.
3.2.2.9. Трансформация клеток E.coli.
Для трасформации клеток E.coli использовались кальциевую методику. Калъииевая методика трансформаиии.
Бактериальные клетки E. coli штамма NM522 выращивали в течение 18 часов в 10мл среды 2xYT, содержащей ампицилин в конечной концентрации 15 мкг/мл, при 37°С. 1 ООцЕ ночной культуры разводили в 10мл свежей 2xYT. Клетки подращивали при 37°С в течение часа. Пробирку охлаждали до 10°С в ледяной бане. Затем переливали клетки в охлажденные до 0°С центрифужные пробирки и центрифугировали 5 минут при 4000 об/мин при 0°С. Супернатант тщательно удаляли. Осадок ресуспендировали в 5мл 50мМ раствора MgCl2. Затем снова центрифугировали в тех же условиях, и удаляли супернатант. Ресуспендировали осадок в 1мл ЮОмМ раствора хлорида кальция и 50мМ хлорида марганца. Клеточную суспенцию выдерживали в ледяной бане 40-90 минут и разливали в пробирки по 200uL.
К полученной аликвоте клеток добавляли раствор ДНК объемом не более 10pL, перемешивали и оставляли на полчаса в ледяной бане. Затем пробирки помещали в термоблок на 42°С на 2 минуты, а затем выдерживали 3 минуты при комнатной температуре. Добавляли 800цЕ среды 2xYT, перемешивали и инкубировали 1 час при 37°С. Затем высеивали на чашки с твердой средой, и оставляли на ночь на 37°С. Ожидаемая эффективность трансформации данной методики - 107 трансформантов на 1 мкг плазмидной ДНК.
3.2.2.10. П11Р - анализ с колоний.
Селекцию клонов проводили методом ПЦР, используя для гена UL23 праймеры TKf и ТКг, а для гена UL30: UL30-CDS-5' и UL30-CDS-3'
С чашек отбирали отдельные бактериальные колонии и пересевали их в пробирки с 10мл среды 2xYT с ампицилин ом 50 мкг/мл. Клетки растили в течение ночи при 37°С. Из каждой пробирки отбирали lpL ночной культуры и