Получение и характеристика устойчивых к патогенам трансгенных растений с повышенной биобезопасностью

• Автор: Лебедева, Анна Александровна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 126 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ЕЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ЕЕ Структура и механизм действия антимикробных пептидов
ЕЕЕ Классификация антимикробных пептидов
ЕЕ2. Механизм действия антимикробных пептидов
1.1.3. Терапевтическое применение антимикробных пептидов
1.1.4. Некоторые особенности антимикробного пептида цекропинаР1
1.2. Применение генов антимикробных пептидов для создания трансгенных растений
1.3. Стратегии создания биобезопасных безмаркерных растений
1.3.1. Котрансформация маркерного и целевого генов
1.3.2. Получение безмаркерных растений с использованием транспозонов
1.3.3. Применение систем сайт-специфической рекомбинации для эксцизии маркерных генов из генома трансгенных растений
1.3.4. Методы трансформации без использования селективных
маркеров
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объекты исследования и оборудование
2.2. Реактивы, растворы и ферменты
2.3. Микробиологические среды
2.4. Среда для культивирования растений
2.5. Бактериальные штаммы и плазмиды
2.6. Получение генетических конструкций для трансформации растений
2.7. Регенерация побегов рапса
2.8. Клональное микроразмножение и регенерация побегов каланхоэ

2.9. Агробактериальная трансформация растений
2.10. Трансформация растений методом вакуумной агроинфильтрации
2.11. Контроль наследования трансгенов
2.12. Выделение и очистка плазмидной ДНК
2.13. Приготовление компетентных клеток Agrobacteriu.ni Ште/аЫет
и их трансформация
2.14. Электрофорез ДНК в полиакриламидном геле
2.15. Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.16. Выделение суммарной растительной ДНК для ПЦР-анализа
2.17. Анализ геномной ДНК трансгенных растений методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)
2.18. Выделение белка из растений
2.19. Электрофорез белка в трицин/БББ ПААГе
2.20. Вестерн-блот анализ
2.21. Элюция ДНК из агарозного геля
2.22. Элюция ДНК из полиакриламидного геля
2.23. Перенос ДНК на нейлоновый фильтр из колоний на чашках
2.24. Получение радиоактивно меченых препаратов ДНК
2.25. Гибридизация на фильтрах по Саузерну
2.26. Колонизация трансгенных растений ассоциативными микроорганизмами
2.27. Тестирование растений на стабильность присутствия ассоциативных микроорганизмов после колонизации
2.28. Определение уровня экспрессии цекропина Р1 методом ингибирования роста клеток в жидкой среде
2.29. Определение антибиотической активности экстрактов трансгенных растений методом радиальной диффузии
2.30. Биотесты по определению устойчивости трансгенных растений к фитопатогенным микроорганизмам

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ЗЛ. Получение генетических конструкций с искусственным геном
антимикробного пептида цекропина Р1
3.2. Получение трансгенных растений с рекомбинантным вектором рОА482::сесР1 и их молекулярно-генетический анализ
3.2.1. Получение и анализ трансгенных растений рапса и картофеля
3.2.2. Получение и анализ трансгенных растений каланхоэ перистого с геном цекропина Р1
3.3. Получение трансгенных растений рапса с рекомбинантным вектором рРСУ91::сесР1 с четырехкратным промотором СаМУ 35Ь
3.4. Получение безмаркерных трансгенных растений
с геном цекропина Р1
3.5. Исследование совместимости цекропин Р1 -содержащих растений
с полезными ассоциативными микроорганизмами
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

al, 2010). Однако эффективность получения таких безмаркерных растений после реципрокного скрещивания полученных трансформантов составляла не более 4-6%.
1.3.2. Получение безмаркерных растений с использованием транспозонов
Перемещение генов с использованием транспозиции ДНК
Для получения безмаркерных растений можно использовать мобильные генетические элементы, такие как элементы Ac/Ds кукурузы. Автономный Ас-элемент ответственен за синтез фермента транспозазы, осуществляющего миграцию сайта ДНК, и за функцию встраивания, которую определяют инвертированные концевые повторы (Gorbunova & Levy, 2000). Ds-элемент может перемещаться по хромосоме только в присутствии в геноме Ас-элемента. Показано, что транспозоны кукурузы сохраняют свою активность и при переносе в другие виды растений, такие как томат, табак и арабидопсис (Masterson et al., 1989; Goldsbrough et al., 1993; Honma et al, 1993).
Разработаны два вида векторов для удаления селективных маркеров из растений с использованием транспозонов. В одном случае инвертированными повторами Ds фланкирован целевой ген, в другом -маркерный ген. Особенность первой стратегии состоит в том, что можно получить растения с различным уровнем синтеза целевого белка, поскольку трансген перемещается в различные локусы за счет активности эндогенной транспозазы Ас. При этом целевой ген в результате перемещения внутри генома теряет сцепление с селективным геном и возможно получение потомства, имеющего только целевой ген (Goldsbrough et al., 1993). Во втором случае селективный ген можно удалить с помощью транспозазы после повторной трансформации растений агробактериями с геном Ас или в результате скрещивания с растениями, синтезирующими транспозазу.