Использование 3'-нетранслируемой области вируса некротического пожелтения жилок свеклы в качестве индуктора устойчивости к ризомании

• Автор: Виноградова, Светлана Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 139 с. : ил.

Оглавление
1 Список сокращений
2 Введение
2.1 Актуальность проблемы
2.2 Цель и задачи работы
3 Обзор литературы
3.1 Ризомания сахарной свеклы
3.1.1 Географическое распространение BNYVV
3.1.2 Вредоносность и экономическое значение BNYVV
3.1.3 Растения-хозяева BNYVV
3.1.4 Симптомы заболевания ризоманией
3.1.5 Способы переноса и распространения вируса
3.1.6 Морфология частиц и организация генома
3.1.7 Типы и изоляты BNYVV
3.1.8 Способы предотвращения распространения ризомании
3.1.9 Устойчивость к вектору P. betae
3.1.10 Селекция на устойчивость к BNYVV
3.2 Использование трансгенных растений для индукции вирусоустойчивости
3.2.1 Трансгенная устойчивость, обусловленная экспрессий в растении гена белка оболочки вируса
3.2.2 Трансгенные растения, экспрессирующие репликазные гены
3.2.3 Трансгенная устойчивость, основанная на экспрессии транспортного белка
3.2.4 Трансгенная устойчивость, обусловленная экспрессией антител к вирусам
3.2.5 Устойчивость, обусловленная активацией системной приобретенной устойчивости (SAR) растения
3.2.6 Вирусоустойчивость растений, обусловленная "замолканием генов"
3.2.7 Заключение
4 Материалы и методы
4.1 Конструирование бинарных векторов, содержащих кДНК фрагменты генома
BNYVV
4.1.1 Питательная среда, использованная для культивирования Escherichia coli и A. tumefaciens
4.1.2 Получение электрокомпетентных клеток E
4.1.3 Трансформация компетентных клеток E
4.1.4 Выделение плазмидной ДНК из клеток E
4.1.5 Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот
4.1.6 Выделение ДНК из агарозного геля
4.1.7 Трансформация A. tumefaciens
4.1.8 Клонирование кДНК гена БО BNYVV для конститутивной экспрессии в растениях
4.1.9 Клонирование кДНК З’-нетранслируемой области РНК-2 BNYVV для конститутивной экспрессии в растениях
4.1.10 Клонирование конструкции-мишени для PTGS
4.1.11 Оценка эффективности использования для индукции сайленсинга фрагментов BNYVVsil с помощью транзиентной экспрессии в растениях N. benthamiana дикого типа
4.1.12 Выделение растворимого белка из растительного материала
4.1.13 Вестерн блот анализ
4.2 Методики, использованные при работе с культурой in vitro N. benthamiana

4.2.1 Растительный материал
4.2.2 Питательная среда, использованная для поддержания растений культуры in vitro и агробактериальной трансформации
4.2.3 Введение семян в культуру in vitro
4.2.4 Определение концентрации фосфинотрицина для селекции in vitro трансформантов N. benthamiana, содержащих ген bar
4.2.5 Трансформация N. benthamiana с помощью A. tumefaciens
4.2.6 Отбор фосфинотрицин-устойчивых регенерантов на селективной питательной среде
4.2.7 Клональное микроразмножение в условиях in vitro
4.2.8 Адаптация растений к почвенным условиям
4.2.9 Получение поколения Тi и Т2 трансгенных растений N. benthamiana
4.3 Анализ наличия и экспрессии трансгенных вставок в растениях N. benthamiana
4.3.1 Выделение суммарной ДНК из растительного материала
4.3.2 Выделение суммарной РНК из растительного материала
4.3.3 Проведение реакции обратной транскрипции
4.3.4 Проведение полимеразной цепной реакции
4.3.5 Анализ наличия трансгенной вставки в трансформантах
4.3.6 Анализ экспрессии трансгенной вставки методом ОТ-ПЦР
4.3.7 Вестерн блот анализ экспрессии трансгенной вставки
4.3.8 Иммунохроматографический анализ экспрессии РАТ в трансгенных

растениях
4.3.9 Оценка индукции сайленсинга фрагментом BNYVVsil с помощью транзиентной экспрессии в трансгенных растениях N. benthamiana поколения То и Т2
4.4 Анализ устойчивости трансгенных растений N. benthamiana поколения Т2 к механической инокуляции BNYVV
4.4.1 Получение инокулюма BNYVV на растениях N. benthamiana дикого типа
4.4.2 Оценка устойчивости трансгенных растений к BNYVV в условиях теплицы
4.4.3 Обнаружение BNYVV методом ОТ-ПЦР
4.4.4 Обнаружение BNYVV методом ИФА
4.4.5 Обнаружение BNYVV с помощью Вестерн блот анализа
Результаты и обсуждение
5.1 Конструирование бинарных векторов, содержащих кДНК фрагменты генома BNYVV
5.2 Оценка индукции сайленсинга фрагментом BNYVVsil с помощью транзиентной экспрессии в растениях N. benthamiana дикого типа
5.3 Получение трансгенных растений N. benthamiana, несущих фрагменты генома BNYVV
5.3.1 Агробактериальная трансформация N. benthamiana и отбор трансформантов
5.3.2 Определение наличия целевой вставки в геноме трансформантов N. benthamiana методом ПЦР
5.4 Молекулярный анализ трансгенных растений N. benthamiana поколения То
5.4.1 Анализ экспрессии (транскрипции) трансгенной вставки методом ОТ-ПЦР
5.4.2 Иммунохроматографический анализ экспрессии РАТ в трансгенных растениях N. benthamiana поколения То
5.4.3 Вестерн блот анализ трансгенных растений BNYVVcp
5.4.4 Оценка индукции сайленсинга фрагментом BNYVVsil с помощью транзиентной экспрессии в трансгенных растениях N. benthamiana поколения Т0
5.5 Получение и анализ трансгенных растений N. benthamiana поколения Ц и Т2
5.6 Получение инокулюма BNYVV
5.7 Анализ устойчивости трансгенных растений N. ЪепМшткта поколения То к механической инокуляции ВКУУУ
6 Выводы
7 Список литературы
8 Приложение!

Pandolfmi et al., 2003; Abhary et al., 2006; Lopez et al., 2010; Yu et al., 2011; Hu et al, 2011).
3.2.1 Трансгенная устойчивость, обусловленная экспрессий в растении гена белка оболочки вируса
Впервые технология экспрессии вирусного гена БО была применена для индуцирования устойчивости к вирусу табачной мозаики (TMV) в трансгенном табаке (Powell-Abel et al., 1986). В результате экспрессии БО наблюдали задержку развития симптомов на трансгенных растениях после заражения TMV.
Технология БО-зависимой устойчивости применялась к большому количеству вирусов различных таксономических групп и для широкого спектра культивируемых сельскохозяйственных культур (Beachy et al., 1990; Baulcombe, 1996; Beachy, 1997; Campbell et al., 2002; Prins et al, 2008). Среди растений, устойчивость которых основана на экспрессии вирусного БО, в коммерческих целях используется трансгенная папайя, устойчивая к вирусу кольцевой пятнистости папайи (PRSV) (Gonsalves 1998), тыква к вирусу огуречной мозаики (CMV), вирусу желтой мозаики тыквы обыкновенной (ZYMV), вирусу мозаики арбуза (WMV) (Tricoli et al., 1995; Gottula and Fuchs, 2010).
Несмотря на большое количество исследований, молекулярный механизм БО-зависимой устойчивости полностью неясен и, по-видимому, отличается для различных вирусов и проявляется в неодинаковой степени устойчивости. В случае, если трансген запускает и белок-, и РНК-зависимые механизмы, может достигаться высокий уровень вирусоустойчивости (Prins et al.,2008).
Коо et al. (2004) были подытожены некоторые факты, свидетельствующие о интерференции БО TMV дикого типа и трансгенного БО в растениях табака на «раздевание» вириона на самых ранних этапах инфекции: трансгенные растения, экспрессирующие БО TMV, обладают