Клонирование, экспрессия и поиск белков-партнеров нового селен-содержащего белка млекопитающих : SelV

• Автор: Варламова, Елена Геннадьевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 112 с. : ил.

 СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИИ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Селеноцистеин-двадцать первая аминокислота
1.1. Химический элемент селен. Преимущества перед серой
1.2. Эволюционное происхождение селеноцистеина
1.2.1. Идентификация селен- содержащих белков т хШсо
1.2.2. Филогенетическое распределение селен- содержащих белков
1.3. Биосинтез и механизм встраивания селеноцистеина в синтезируемые полипептидные цепи
2. Роль селена в здоровье человека
2.1. Участие селена в сперматогенезе
2.2. Селен-содержащие белки, экспрессирующиеся в семенниках
3. Суперсемейство тиоловых оксидоредуктаз
3.1. Лбх- семейство тиоредоксин подобных белков
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Материалы
2. Методы
2.1. Биоинформационный анализ
2.2. Выделение нуклеиновых кислот

2.3. Методика проведения обратной транскрипции и ПЦР
2.4. Клонирование и сайт- направленный мутагенез
2.5. Экспрессия и очистка рекомбинантного белка
2.6. Идентификация белков- партнеров методами аффинной хроматографии и ко- иммуннопреципитации
2.7. Транзиентная трансфекция, иммунофлюоресценция, конфокальная микроскопия
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Биоинформационный анализ первичной последовательности БеГУ
2. Определение внутриклеточной локализации 8е1У и его 14- и С-концевых доменов
3. Идентификация белков-партнеров БеГУ
4. Исследование специфичности взаимодействия 8е1У с его потенциальными партнерами методом ко-иммунопреципитации
5. Определение степени ко-локализации БеГУ и его белков-партнеров
6. Экспрессия мРНК БеГУ в семенниках крысы в процессе сперматогенеза и онтогенеза
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ПУБЛИКАЦИИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
Se селен
Sec селеноцистеин
SelH селен-содержащий белок Н
SelL селен-содержащий белок L
SelM селен-содержащий белок М
SelT селен-содержащий белок Т
SelV селен-содержащий белок V
SelW селен-содержащий белок W
GPX глутатионпероксидаза
OGT О-связанная N- ацетилглюкозаминтрансфераза
ASB семейство белков, содержащих анкириновые повторы и SOCS-домен-супрессор сигнализации цитокинов
Trx тиоредоксин
GSH глутатион восстановленный
SECIS последовательность, необходимая для встраивания Sec в полипептиды
PACAP пептид, активирующий аденилатциклазу
ОТ-ПЦР обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция
ПЦР полимеразная цепная реакция
ПААГ-электрофорез электрофорез в полиакриламидном геле
dNTP смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов
SDS додецилсульфат натрия
DTT дитиотрейтол
BSA бычий сывороточный альбумин
GFP зеленый флуоресцентный белок

тиоционат и 0.1% (З-меркаптоэтанол. Полученный гомогенат использовали для выделения РНК.
Выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток штамма Тор 10 выполняли с помощью наборов «Plasmid Purification Mini Kit» и «Plasmid Purification Midi Kit» («Qiagen»). Для высвобождения плазмидной ДНК, бактериальные клетки подвергали щелочному лизису в присутствии 1% додецилсульфата натрия. Полученный лизат нейтрализовали раствором 1М ацетата калия, pH 5.0, наносили ДНК на мембрану колонки. Для удаления примесей адсорбированную ДНК промывали раствором 1М хлорида натрия, 15% изопропанола, 50мМ MOPS, pH 7.0. Очищенную плазмиду элюировали небольшим количеством Трис-буфера.
Для очистки продуктов ПЦР использовали протокол «QIAquick PCR Purification Kit Protocol» («Qiagen»), предназначенный для очистки одно- и двух-цепочечных фрагментов ДНК из реакционной смеси после прохождения ПЦР и других ферментативных реакций. При выделении и очистке продуктов ПЦР из агарозного геля применяли «QIAquick Gel Extraction Kit Protocol» («Qiagen»),
Концентрацию ДНК/РНК определяли с помощью спектрофотометра NanoDrop ND-1000(«NanoDrop Technologies»,США) при длине волны 260 нм.
2.3. Методика проведения обратной транскрипции и ПЦР
Реакцию обратной транскрипции проводили по протоколу и с использованием наборов реактивов, предоставленных «Fermentas» («RevertAid Н Minus First cDNA Synthesis Kit»), а также «Promega» («Access RT-PCR System»). Количество тотальной РНК в реакционной смеси составило 3 мкг. Реакцию проводили с помощью oligodT праймеров.
Протоколы проведения реакций обратной транскрипции с помощью наборов реактивов «RevertAid Н Minus First cDNA Synthesis Kit»