Взаимодействие флуоресцентных красителей с полиэлектролитными микрокапсулами. Разработка флуоресцентных хемо- и биосенсоров

• Автор: Казакова, Любовь Игоревна
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 105 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Методы экспресс-анализа в клинико-лабораторной диагностике

И МЕСТО В НИХ
СЕНСОРНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ
2.2. Применение нано- и микроносителей в создании сенсоров
2.2.1. Типы нано- и микрочастиц, применяемых для создания сенсоров
: С"осооы мобилизации биологического материала на нано- и микроносителях 15 Оптические сенсоры на основе нано- и микрочастиц / у
2.3. ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫЕ НАНО- И МИКРОКАПСУЛЫ
2.3.1. Образование, строение и свойства интерполиэлектролитных комплексов.''..21 подпожкУЧете' Стр0ение 11 свойства полиэлектролитных пленок на плоских

2.3.3. Формирование полиэлектролитных капсул
2.3.4. Ядра для формирования полиэлектролитных капсул у б
2.3.5. Способы включения флуоресцентных красителей в полиэлектролитные кап(улы28
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. МАТЕРИАЛЫ И РЕАКТИВЫ
3.2. Получение микросферолитов СаС03
3.3. Получение биоминеральных ядер С аС03/белок
3.4. Формирование полт
БИОМИНЕРАЛЬНЫХ ЯДРАХ
3.5. ФОРМИРОВАНИЕ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫХ МИКРОКАПСУ11с'иСПОЛЬЗОВМФ1ЕМЧАСТИи ОКСИДА КРЕМНИЯ
3.6. Определение концентрации белков в капсулах."'"'."1'
3.7. Определение ферментативной активности уреазы ””
3.8. Сканирующая электронная микроскопия полученных микрокапсул и ядер ИСПОЛЬЗОВАННЫХ для ИХ ФОРМИРОВАНИЯ
3.9. ТРАНСМИССИОННАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ. ПОЛУЧЕНИЕ УЛЬТРАТОНКИХ СРЕЗОВ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫХ МИКРОКАПСУЛ
3.10. СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЕИССЛЕДОВАНИЯ
3.11. ФЛУОРИМЕТРИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.12. КОНФОКАЛЬНАЯ ЛАЗЕРНАЯ СКАНИРУЮЩАЯ МИЮЮСКОПТМ НОЛИЭлЁкТРОЛИТНЬК
МИКРОКАПСУЛ
полиэлектролитных микрокапсулна’тосфлитСаСОз и'32
3.13. Определение параметров взаимодействия мероцианина540 с полиалшламином
36 )М
3.14. Определение константы диссоциации Са2+ и СаЁсшм (Зтшеы-Т1
3.15. Определение константы ассоциации Н+ и БИЛДТ
3 .16. Измерение интенсивности флуоресценции одиночный пошэлектлЁжк
КАПСУЛ
3.17. Статистические расчеты

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Исследование ультраструктурной организации полиэлектролитных шкрокапсул, сформированных с использованием минеральных и биоминеральных

4.1.1. Морфология ядер 8Ю2, СаСОз и биоминеральных ядер СаС03-БСА

4.1.2. Ультраструктурная организация капсул, сформированных на ядрах S1O2
4.1.3. Ультраструктурная организация капсул, сформированных на микросферолитах СаСОз
4.1.4. Ультраструктурная организация капсул, сформированных на ядрах СаС03-БСА
4.1.5. Распределение белков внутри полиэлектролитных микрокапсул
4.2. Изучение взаимодействия амфифильного флуоресцентного зонда
МЕРОЦИАНИНА540 С ПОЛИЭЛЕКТРОЛШНЫМИ МИКРОКАПСУЛАМИ
4.2.1. Предварительные эксперименты, выбор флуоресцентного зонда
4.2.2. Взаимодействие мероііианина540 с полистиролсульфонатом
4.2.4. Взаимодействие мероцианина540 с полиаллиламином
4.2.5. Взаимодействие мероцианина540 с иктерполиэлектролитнът комплексом
4.2.6. Взаимодействие мероцианина540 с полиэлектролитными микрокапсулами
4.3. Иммобилизация флуоресцентных красителей в полиэлектролитные микрокапсулы
4.4. Разработка хемосенсоров на основе полиэлектролитных микрокапсул
4.4.1. Разработка хемосенсора для определения концентрации растворенного кислорода
4.4.2. Разработка хемосенсора для определения ионов кальция
4.5. Разработка биосенсоров на основе полиэлектролитных микрокапсул
4.5.1. Разработка биосенсора для определения глюкозы
4.5.2. Разработка биосенсора для определения лактата
4.5.3. Разработка биосенсора для определения мочевины
5. ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
БАВ- биологически активные вещества
БСА - бычий сывороточный альбумин
ИПЭК - интерполиэлекгролитный комплекс
МФ-частицы - меламинформальдегидные частицы
МЦ540 - мероцианин540
П АА - поли(аллиламин)гидрохлорид
ПАП - последовательная адсорбция полиэлектролитов
ПДАДМА - поли(диаллилдимешламмоний)хлорид
ПСС - поли(стиролсульфонат)
ПС-частицы - полистирольные частицы ПЭ - полиэлектролит, полиэлектролитный ПЭМК — полиэлектролитные микрокапсулы СЭМ - сканирующая электронная микроскопия ТРИТЦ - Тетраметилродамин изотиоцианат ТЭМ - трансмиссионная электронная микроскопия ФИТЦ - флуоресцеин изотиоцианат ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

Негативы морфометрировали, используя фотоувеличитель «Микрофот» (ГДР) при фиксированном 6,5- и 9-кратном увеличении. Измерение толщины оболочек полиэлектролитных микрокапсул производилось путем оценки 3-5 микрофотографий в 10 разных точках каждой капсулы с различной степенью сформ1фованности полиэлектролигой оболочки. Данные представлены как средние значения толщины.
Получение и исследование срезов полиэлектролитных микрокапсул проводили совместно с сотрудниками Лаборатории Ультраструктуры нейрона Д. А. Мошковым и И.М Санталовой (ИТЭБ РАН, Пущино).
3.10. Спектрофотометрические исследования
Все спектрофотометрические измерения проводили на спектрофотометре Сагу 100 (Vanan Inc.) в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 10 мм, при 20°С и постоянном перемешивании.
3.11. Флуориметрические исследования
Исследования проводились на спектрофлуориметре Cary Eclipse (Varian inc Австралия), при температуре 20“С и постоянном перемешивании. Использовались кварцевые кюветы с длиной оптического пути 10 мм.
3.12. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия полиэлектролитных микрокапсул
Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия выполнена на конфокальном микроскопе Leica Confocal Laser Scanning Microscope TCS SP. Для визуализации использовали инвертированный иммерсионный объектив с увеличением хюо.
3.13. Определение параметров взаимодействия мероцианина540 с полиаллиламином
Проводили спектрофлуориметрическое титрование водного раствора красителя растворами полиаллиламина (ПАА) или интерполиэлектролитного комплекса ПАА/ПСС. Значения константы (Ка) и стехиометрии связывания (п) мероциашша540 (МЦ540) с ПАА определяли путем варьирования их значений в соответствии с экспериментальными значениями интенсивности флуоресценции в рамках схемы:
МЦ 540 + пИПЭК <—э Комплекс п